本發明專利技術屬于生物學和藥學領域，涉及篩選結核桿菌抑制劑的細胞模型及篩選方法。具體地，本發明專利技術涉及一種細胞，其表達結核桿菌的L12蛋白和L10蛋白，其中，L12的編碼基因與轉錄因子的轉錄激活結構域位于一個表達載體，L10的編碼基因與轉錄因子的DNA結合結構域位于另一個表達載體。本發明專利技術還涉及式I或式II所示的化合物在制備結核桿菌L12蛋白和L10蛋白相互作用阻斷劑、抗結核桿菌藥物、或者治療和/或預防結核病的藥物中的用途。本發明專利技術的細胞模型能夠有效地用于抗結核桿菌藥物的篩選。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于生物學和藥學領域，涉及。
技術介紹
近年來結核病在全球范圍內卷土重來，結核菌的耐藥成為當前結核病治療中所面臨的最嚴重問題。篩選、發現和驗證抗結核藥物的分子靶標，從靶標上實施突破，是獲得新型高效低毒抗結核藥物、解決結核治療特別是耐藥結核治療問題的關鍵所在。核糖體是細胞內蛋白質合成的場所，而細胞生命的維持依賴于蛋白質功能的正 常行使，因此核糖體成為藥物研發的重要祀標(Huntington K M, et al. Synthesis andantibacteria丄 activityof peptide deformylase inhibitors. Biochemistry,2000，39(15) :4543-4551 ；Sinha R R，et al. Thiazoleand oxazole peptides !biosynthesis andmolecular machinery. NatProd Rep，1999，16 (2) :249-263.)。蛋白-蛋白的相互作用是生命活動中廣泛而重要的相互作用，是蛋白質正常行使其功能的重要條件，因此蛋白-蛋白相互作用是藥物靶標研究的另一重要方向。微生物核糖體蛋白由50S大亞基和30S小亞基組成，大亞單位含有23SrRNA，5SrRNA與30多種蛋白質，小亞單位含有16SrRNA與20多種蛋白質。這些蛋白復合并與核糖組成核糖體正常行使其功能。在微生物核糖體組成蛋白中，眾多蛋白作為組成型或功能型亞基協同發揮作用。目前，已經發現多個蛋白間的相互作用機制，如通過共結晶方法證實E.coli核糖體大亞基組成蛋白L12和LlO存在相互作用(Gudkov, A. T. The L7/L12 ribosomaldomain of the ribosome !structural andfunctional studies. FEBS Lett，1997，407 :253-256.)。L12(L7/L12)(編碼基因是rplL)是核糖體組成蛋白中唯一的多拷貝蛋白，其中L12是正常的，L7是N末端絲氨酸氨酰化的蛋白，二者以4 I比例的ニ聚體形式存在，簡稱L12。在核糖體中L12對于轉錄的有效性和精確性是重要的，井能夠激發轉錄因子的GTP激酶活性。在L12的N末端有兩個與LlO結合的部位，L12功能的發揮依賴LlO (編碼基因是 rplj)將其錨定于大亞基(Mihaela Diacnu, et al. Structural Basis for theFunctionof the Ribosome L7/L12 Stalk in Factor Binding and GTPaseActivation.Cell，2005，121 :991-1004 ;Griaznova 0，Traut RR. Deletion of C-terminal residuesof Escherichia coli ribosomalprotein LlO causes the loss of binding of one L7/L12 dimer ribosomes with one L7/L12 dimer are active. Biochemistry,2000,39(14)4075-4081.) oL12和LlO在結核桿菌中與E. coli中具有高度的保守性，S. T. Cole的研究也表明結核桿菌中的L12與LlO具有相互作用(S.T.Cole，R. Brosch, J. Parkhill, etal. Deciphering the biology ofMycobacterium tuberculosis from the completegenome sequence. Nature，1998，393，537-544.)。L12 與 LlO 相互作用的正常進行是結核桿菌正常生長所必須的；而L12和LlO的編碼基因在結核桿菌內具有保守性并且與人類基因具有很低的同源性，因此具備作為抗結核藥物靶標的基本條件。盡管L12和LlO的相互作用已經通過共結晶方法進行驗證，但是能否能在生物模型中驗證結核桿菌的L12和LlO相互作用，這種相互作用能否用于新型抗結核藥物篩選，仍需要進ー步的研究。
技術實現思路
本專利技術人經過創造性的勞動和大量的試驗，首次利用酵母雙雜交的方法(Fieldsb, Song O. A novel genetic system to detect protein—protein interaction. Nature,1989,340 :245-246 ；M Yang,Z ffu,an dFields S.Protein-peptide interactions analyzedwith he yeast two-hybrid System. Nucleic Acids Res, 1995, 23 :1152-1156.)證明了結核桿菌L12和LlO之間的相互作用。并且驚奇地發現，L12和LlO在酵母細胞中能夠相互作用，使得酵母雙雜交系統載體中的真核轉錄因子的DNA結合結構域和轉錄激活結構域在空間上也相互接近，形成完整的轉錄因子，從而激活宿主菌報告基因的表達。本專利技術人基于此建立了 L12和LlO相互作用阻斷劑的體外高通量篩選模型(圖I)，并利用此模型對4000個化合物進行篩選，成功發現了具有體外抗結核活性的陽性候選化合物。由此提供了下述專利技術本專利技術的ー個方面涉及ー種細胞，其表達結核桿菌核糖體蛋白L12和L10，其中，L12的編碼基因與轉錄因子的轉錄激活結構域(AD)位于ー個表達載體，LlO的編碼基因與轉錄因子的DNA結合結構域(BD)位于另ー個表達載體。所述的兩個表達載體是不同的。具體地，所述載體可以是pGBKT7、pGADT7等。根據本專利技術任一項所述的細胞，其為酵母細胞。根據本專利技術任一項所述的細胞，其中，所述轉錄因子為GAL4。根據本專利技術任一項所述的細胞，其中，L12蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0:1所示，LlO蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。MAKLSTDELLDAFKEMTLLELSDFVKKFEETFEVTAAAPVAVAAAGAAPAGAAVEAAEEQSEFDVILEAAGDKKIGVIKVVREIVSGLGLKEAKDLVDGAPKPLLEKVAKEAADEAKAKLEAAGATVTVK(SEQ ID NO 1)MARADKATAVADIAAQFKESTATLITEYRGLTVANLAELRRSLTGSATYAVAKNTLIKRAASEAGIEGLDELFVGPTAIAFVTGEPVDAAKAIKTFAKEHKALVIKGGYMDGHPLTVAEVERIADLESREVLLAKLAGAMKGNLAKAAGLFNAPASQLARLAAALQEKKACPGPDSAE(SEQ ID NO 2)根據本專利技術任一項所述的細胞，其中，L12蛋白的編碼基因的核苷酸序列序列如SEQ ID NO :3(rplL，GeneID :888078)所示，LlO蛋白的編碼基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:4(rplJ, GeneID :888049)所示。本文檔來自技高網...
【技術保護點】
【技術特征摘要】
1.一種細胞，其表達結核桿菌核糖體蛋白L12和L10，其中，L12的編碼基因與轉錄因子的轉錄激活結構域位于ー個表達載體，LlO的編碼基因與轉錄因子的DNA結合結構域位于另ー個表達載體。2.根據權利要求I所述的細胞，其滿足如下的(1)-(3)中的一項或者多項 (1)所述細胞為酵母細胞； (2)所述轉錄因子為GAL4； (3)L12蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO :1所示，LlO蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。3.根據權利要求I所述的細胞，其中，L12蛋白的編碼基因的核苷酸序列序列如SEQIDNO 3所示，LlO蛋白的編碼基因的核苷酸序列如SEQ ID NO 4所示。4.根據權利要求I所述的細胞，其中，所述細胞能夠在缺陷性培養基SD/-Trp-Leu_Hi s-Ade 上生長。5.一種用于篩選結核桿菌L12蛋白和LlO蛋白相互作用阻斷劑、抗結核桿菌藥物、或者治療和/或預防結核病的藥物的細胞模型，其包含權利要求1-4中任一項所述的細胞。6.根據權利要求5所述的細胞模型，其還包含空白對照細胞和/或陰性對照細胞；優選地，所述空白對照細胞為不轉染有任何載體的空白酵母細胞，所述陰性對照細胞為染有兩個不同的表達載體的酵母細胞，兩個表達載體中各插入有不同的基因，該兩個不同的基因表達的蛋白能夠相互結合，并且表達的蛋白不是L12和...
【專利技術屬性】
技術研發人員：司書毅，林媛，李妍，王彥昶，蔣建東，肖春玲，洪斌，高娜娜，
申請(專利權)人：中國醫學科學院醫藥生物技術研究所，
類型：發明
國別省市：
還沒有人留言評論。發表了對其他瀏覽者有用的留言會獲得科技券。