本發(fā)明專利技術(shù)公開(kāi)了一株微生物菌株及其應(yīng)用，具體涉及一種煙草煙堿降解菌微桿菌GYC29(Microbacterium?sp.GYC29)CCTCC?NO：M2010311及其在煙草中的應(yīng)用。本發(fā)明專利技術(shù)所公開(kāi)的菌株在生長(zhǎng)過(guò)程中可以分解利用煙堿。將該菌株的發(fā)酵液或菌體按照煙葉重量的1～5％，加入到含水量為10～50％的煙草中，發(fā)酵6～72小時(shí)可以使煙葉的煙堿含量降低2～33％，煙葉刺激性明顯減少，雜氣減少，煙氣變醇和，感官質(zhì)量明顯改善。本發(fā)明專利技術(shù)通過(guò)使用微生物來(lái)實(shí)現(xiàn)降解煙草煙堿，可以適當(dāng)調(diào)整煙葉原料的煙堿含量大小，提高煙葉的可用性。
【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及一株微生物菌株及其應(yīng)用，具體涉及ー種煙草煙堿降解菌一微桿菌GYC29 (Microbacterium sp. GYC29) CCTCC NO M2010311 及其在煙草中的應(yīng)用，屬于微生物應(yīng)用
技術(shù)介紹
煙堿又名尼古丁(Nicotine)，是煙草生物堿中的主要成分。烤煙中煙堿的含量一般在I. 5% 3. 5%,以2. 5%左右為宜。煙堿含量過(guò)低，勁頭太小，煙堿含量過(guò)高，勁頭太大，會(huì)引起刺嗆辛辣感。降低煙草中的煙堿含量，目前主要有三條途徑(I)從農(nóng)業(yè)種植的角度進(jìn)行調(diào)控主要從遺傳、生態(tài)和栽培等方面來(lái)進(jìn)行控制。(2)從化學(xué)的角度煙葉中的生物堿可通過(guò)用熱水漂洗、有機(jī)溶劑萃取、氣體抽提和蒸汽蒸餾等處理煙葉的方法將煙葉中的煙堿脫棹。(3)從微生物和酶的角度從煙葉、煙籽和土壌中分離能夠降解煙堿的微生 物，培養(yǎng)后直接或者分離出酶系后作用于煙葉，降低煙葉中的煙堿含量，從而提高煙葉的可用性。對(duì)于已經(jīng)成熟采收了的煙葉，就只能采用第2和3種方法。其中，使用溶劑抽提等化學(xué)方法雖然可以去除一部分煙堿，但同時(shí)會(huì)引起煙草中的一些致香成分的損失和外觀色澤的顯著變化，從而在一定程度上降低了處理煙葉的可用性。而通過(guò)微生物或酶來(lái)處理煙葉，由于酶具有專ー性，因此可以較好地避免這些問(wèn)題。在微生物降解煙堿方面，C. Enders等早在1947年就對(duì)酵母降解煙堿進(jìn)行了研究，以后逐漸成為人們關(guān)注的課題。國(guó)外一些大的煙草企業(yè)如菲利普莫瑞斯煙草公司、英美煙草公司等很早就利用微生物對(duì)煙草中的煙堿進(jìn)行降解，以此來(lái)滿足一部分消費(fèi)群體對(duì)低尼古丁香煙的需求。目前已報(bào)道的能夠降解煙堿的微生物主要包括2大類酵母和細(xì)菌。國(guó)夕卜報(bào)追如 Deharyomyces nicotianae,Micrococus nicotianae,Pseudomonas, Alcaligenesparadox us, Arthrobacterglobif ormils, Enterobacter cloacae, Cunninghamellaechinulata, Nicotianae plumbaginif olia, Artnrobacter oxidans 等。國(guó)內(nèi)孫君社等(2002)從煙葉倉(cāng)庫(kù)或露天煙垛周圍的土壌中分離出降解煙草煙堿的煙草假單胞菌(Pseudomonas nicotianae)。利用微生物來(lái)處理煙葉,不僅降解了煙葉中的煙堿，改善煙葉的品質(zhì)，還減少對(duì)環(huán)境的污染，提高煙葉資源的利用率，具有較高的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。因此，篩選能夠高效降解煙堿的微生物，用于處理煙草煙葉中的煙堿，具有廣泛的應(yīng)用前景。在已報(bào)道的煙堿降解菌中，尚未有利用微桿菌降解煙堿的報(bào)道。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的主要目的在于提供一種能夠高效降解煙堿的微生物菌株即微桿菌GYC29 (Microbacterium sp. GYC29)，保藏號(hào)為 CCTCC NO :M2010311，及其相應(yīng)的培養(yǎng)條件并公開(kāi)ー種利用微生物降解煙草中的煙堿提高煙葉可用性的方法。本專利技術(shù)通過(guò)如下方案實(shí)現(xiàn)ー種微生物菌株,其特征在于它為微桿菌Microbacterium sp. GYC29,保藏號(hào)為CCTCC NO M2010311 ;菌落黃色，表面光滑不透明邊緣整齊；革蘭氏陽(yáng)性，最適生長(zhǎng)溫度為25-30 °C。所述菌株通過(guò)如下途徑獲得將植煙土壤分別取IOg加入到含有200mL無(wú)菌水的三角瓶中，于30°C，200rpm的搖床搖30min，過(guò)濾，取ImL細(xì)菌懸液轉(zhuǎn)接至另ー個(gè)含200mL富集培養(yǎng)基的三角瓶中，富集培養(yǎng)3d，然后取ImL培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接至另ー個(gè)含200mL煙堿濃度為O. 2%的煙堿培養(yǎng)基的三角瓶中培養(yǎng)3d。將培養(yǎng)物稀釋涂布到煙堿選擇培養(yǎng)基上，經(jīng)分離純化和耐受煙堿能力試驗(yàn)，獲得在O. 8%煙堿濃度培養(yǎng)液中可以旺盛生長(zhǎng)的降解煙堿菌株，即微桿菌Microbacteriumsp.GYC29。所述富集培養(yǎng)基為蛋白胨10g，酵母提取物5. 0g，NaCl 10g，Ig K2HPO4,水1000ml, ρΗ7· O。所述煙堿培養(yǎng)基為0.2w/v % 煙堿，13. 3g K2HPO4 · 3H20，4g KH2PO4,0. 2g MgSO4 · 7Η20，0· 05ml 微量元素，水 1000ml, ρΗ7· O。所述微量元素為0.04g CaCl2,0. 07g CuSO4,0. 008g MnSO4 · H2O, O. 004gFeSO4 · 7Η20，0· Ig Na2MoO4 · 2H20，加 0. Imol ·じ1 的 HCl 溶解定容 IOOmL0所述煙堿選擇培養(yǎng)基為煙堿培養(yǎng)基+1. 5W/v%瓊脂粉。所述菌株的培養(yǎng)步驟為A、斜面培養(yǎng)蛋白胨10g，酵母膏5g，氯化鈉10g，瓊脂15g，蒸餾水1000ml，pH7. 0，將冷凍保存的甘油懸液接種到斜面培養(yǎng)基上，30°C恒溫培養(yǎng)2天；B、搖瓶培養(yǎng)煙堿2g，蛋白胨5g，酵母膏5g，氯化鈉5g，K2HPO4 ·3Η20 13. 3g，KH2PO44g，MgSO4 · 7H20 0. 2g，0. 5ml微量元素，加蒸餾水1000ml，調(diào)pH值為7. 0，高壓蒸汽滅菌；搖瓶裝液量為10 30v/v%，接種量為2 10v/v%，培養(yǎng)溫度為20 40°C，搖床轉(zhuǎn)速為100 200rpm，搖瓶培養(yǎng)I 3天，煙堿降解率達(dá)到85 100%。所述微量元素為-.CaCl20. 04g, CuSO4 0. 07g, MnSO4 · H2O 0. 008g, FeSO4 · 7H200. 004g, Na2MoO4 · 2H20 0. lg,加 0. Imol ·じ1 的 HCl 溶解定容 100ml。所述微桿菌Microbacterium sp. GYC29用于降解煙草中的煙堿；所說(shuō)的用于降解煙草中的煙堿,通過(guò)如下步驟獲得A、將權(quán)利要求I所述的微桿菌Microbacterium sp. GYC29進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng),獲得發(fā)酵液及菌體；B、將步驟a所得的發(fā)酵液或菌體用水、生理鹽水或者緩沖液進(jìn)行稀釋，稀釋后菌液濃度達(dá)到IO6 IO12個(gè)菌/ml，將菌液按照煙葉重量的I 5%，加入到含水量為10 50%的煙草中進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵溫度為10 50°C，發(fā)酵時(shí)間不低于4小吋。其中步驟B中所說(shuō)的緩沖液為巴比妥緩沖液、鄰苯ニ甲酸鹽緩沖液、氨-氯化銨緩沖液、硼砂-氯化鈣緩沖液、醋酸-醋酸鈉緩沖液、醋酸-醋酸銨緩沖液、檸檬酸鹽緩沖液或磷酸鹽緩沖液中的任意ー種。培養(yǎng)后的發(fā)酵液經(jīng)稀釋后菌液濃度達(dá)到IO9個(gè)/ml，將菌液按照煙葉重量的I 5%，加入到含水量為10 50%的煙草中，發(fā)酵6 72小時(shí)，可使煙葉煙堿含量降低，刺激性明顯減少，煙氣醇和，煙葉可用性明顯提高。所述微桿菌Microbacterium sp. GYC29,已于2010年11月24日保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，其簡(jiǎn)稱為CCTCC，保藏編號(hào)為CCTCC NO :M2010311。保藏地址湖北省武漢市武昌珞珈山，郵政編碼430072。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本專利技術(shù)的有益效果為采用本專利技術(shù)來(lái)改善煙葉原料尤其是上部煙葉的品質(zhì)，エ藝過(guò)程簡(jiǎn)單，反應(yīng)條件溫和；經(jīng)過(guò)處理后，煙葉煙堿含量降低 ，刺激性明顯減少，煙氣醇和，煙葉可用性明顯提高。該方法具有簡(jiǎn)單實(shí)用，成本低廉等特點(diǎn)，可望在エ本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
【技術(shù)特征摘要】
1.ー種微生物菌株,其特征在于它為微桿菌Microbacterium sp. GYC29,保藏號(hào)為CCTCC NO M2010311 ;菌落黃色，表面光滑不透明邊緣整齊；革蘭氏陽(yáng)性，最適生長(zhǎng)溫度為25-30 °C。2.如權(quán)利要求I所述的微生物菌株，其特征在于所述菌株通過(guò)如下途徑獲得 首先從土壤或者煙葉中分離出降解煙草煙堿的微生物菌株；然后將獲得的微生物菌株用煙堿選擇培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，經(jīng)分離純化和耐受煙堿能力試驗(yàn)，獲得可以高效降解煙堿的菌株，即微桿菌 Microbacterium sp. GYC29。3.如權(quán)利要求I或2所述的微生物菌株，其特征在于所述菌株的培養(yǎng)步驟為 A、斜面培養(yǎng)蛋白胨10g，酵母膏5g，氯化鈉10g，瓊脂15g，蒸餾水IOOOml，ρΗ7·0，將冷凍保存的甘油懸液接種到斜面培養(yǎng)基上，30°C恒溫培養(yǎng)2天； B、搖瓶培養(yǎng)煙堿2g，蛋白胨5g，酵母膏5g，氯化鈉5g，K2HPO4·3Η20 13. 3g,KH2PO4 4g，MgSO4 · 7H20 0. 2g，0. 5ml微量元素，加蒸餾水1000ml，調(diào)pH值為7. 0，高壓蒸汽滅菌；搖瓶裝液量為10 30v/v%，接種量為2 10v/v%，培養(yǎng)溫度為20 40°C，搖床轉(zhuǎn)速為100 200rpm，搖瓶培...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：龍章德，黃泰松，韋建玉，白森，鄒克興，胡亞杰，蔡聯(lián)合，金亞波，張紀(jì)利，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：廣西中煙工業(yè)有限責(zé)任公司，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：
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