一種檢測組氨酸標簽重組蛋白的核酸適配體分子信標探針及其檢測方法技術

本發明專利技術公開了一種檢測組氨酸標簽的核酸適配體分子信標探針及利用該探針檢測細胞裂解物中組氨酸標簽重組蛋白的直接通用方法。本發明專利技術的核酸適配體探針包含SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示的序列；SEQIDNO.1所示序列的3’端與SEQIDNO.2所示序列的5’端通過PEG36橋聯；SEQIDNO.1所示序列5’端修飾有熒光素FAM；SEQIDNO.2所示序列3’端修飾有淬滅基團Dabcy1。利用本發明專利技術的核酸適配體分子信標探針，不需蛋白質標記并可快速定量分析細胞裂解液中組氨酸標簽重組蛋白質表達，本發明專利技術的方法具有普遍、廉價并且可以簡單快速定量分析組氨酸標簽重組蛋白的優點。

Nucleic acid aptamer molecular beacon probe for detecting histidine tag recombinant protein and detection method thereof

The present invention discloses a nucleic acid aptamer molecular beacon probe for detecting histidine tag and a direct universal method for detecting histidine tag recombinant protein in cell lysate by using the probe. The nucleic acid aptamer sequence contains SEQIDNO.1 and SEQIDNO.2 shown in the SEQIDNO.1; 3 'end sequences shown with SEQIDNO.2 shown in sequence 5' end of PEG36 through SEQIDNO.1 bridging; shown in sequence 5 'end modified with fluorescein FAM; SEQIDNO.2 shown in sequence 3' end modified quencher Dabcy1. The use of the nucleic acid aptamer molecular beacon probe without protein labeling and rapid quantitative analysis of cell lysates of histidine tagged recombinant protein expression, the method of the invention has the advantages of cheap and universal, histidine tagged recombinant protein analysis simple and rapid quantitative.

【技術實現步驟摘要】

本專利技術屬于生物
，具體涉及一種檢測組氨酸標簽重組蛋白的核酸適配體分子信標探針及利用該探針進行組氨酸標簽重組蛋白檢測的方法。
技術介紹
蛋白表達系統及其重組蛋白已被廣泛應用于生命科學的各個學科研究，已經成為生物學有力的研究手段和工具。然而，從原生生物資源中分離和純化重組蛋白的過程是非常復雜和耗時。為了簡化這一過程，多種蛋白質親和標簽，如幾丁質結合蛋白、麥芽糖結合蛋白、谷胱甘肽-S-轉移酶和多聚組氨酸標簽，被廣泛用于重組蛋白分離和純化。其中最常用的是在重組蛋白的N-或C-末端添加六個組氨酸殘基的組氨酸標簽。·與其它蛋白標簽方法相比，組氨酸標簽具有以下優點1.分子量小，對目標蛋白功能、結構及活性的干擾作用較小，在后續應用中通常不需移除；2.表達方便，商品化含組氨酸標簽的載體可在大腸桿菌、酵母、哺乳動物、昆蟲和植物等不同表達系統中表達且純化條件溫和；3.無免疫原性，重組蛋白可以直接用來注射動物制備抗體，不影響免疫學分析；4.在高濃度尿素或胍等變性條件下，組氨酸標簽仍保持結合能力。因此，目前組氨酸標簽被廣泛用于蛋白表達系統和蛋白質分析。準確定量組氨酸標簽重組蛋白將有助于表達載體和表達系統的評估及重組蛋白的應用。目前，檢測組氨酸標簽蛋白的探針主要有兩類抗組氨酸標簽抗體和金屬離子探針。但是這兩類探針在應用上卻受到了一定限制。組氨酸標簽抗體抗體制備昂貴，檢測時需要較長時間且缺乏準確定量能力。與抗體檢測探針相比，金屬離子探針價格低廉，但同樣耗時和缺少準確定量能力。最重要的是，這兩種方法都不能直接對細胞裂解物中組氨酸標簽蛋白進行檢測和定量分析。核酸適配體是一種通過SELEX技術篩選獲得的單鏈核酸。通過折疊成特定的空間三維結構，核酸適配體能高親和性和高特異性的結合多種目標物，例如金屬離子、有機小分子、多肽、蛋白質和細胞。另外，核酸適配體還具有制備簡單、容易修飾和保存時間長等優點。因此核酸適配體被廣泛應用于分析化學和生命科學等領域，如抗組氨酸標簽核酸適配體 6H5 (5J-GGCTTCAGGTTGGTCTGGTTGGGTTTGGCTCCTGT GTACG-3’)被作為一種親和探針檢測與純化組氨酸標記蛋白。
技術實現思路
本專利技術旨在克服現有技術中的不足，提供一種檢測組氨酸標簽重組蛋白的核酸適配體分子信標探針及利用該探針檢測細胞裂解物中含組氨酸標簽重組蛋白的直接通用方法。為了達到上述目的，本專利技術提供的技術方案為所述檢測組氨酸標簽的核酸適配體分子信標探針包含SEQ ID NO. I和SEQ ID NO. 2所示的序列；SEQ ID NO. I所示序列的3’端與SEQ ID NO. 2所示序列的5’端通過PEG36橋聯；SEQ ID NO. I所示序列5’端修飾有熒光素FAM ；SEQ ID NO. 2所示序列3’端修飾有淬滅基團Dabcyl。當所述探針未與組氨酸標記蛋白結合時,整個探針為莖環結構。在這結構中，探針中FAM基團的熒光信號被Dabcyl基團猝滅。當所述核酸適配體分子信標探針與含組氨酸標簽重組蛋白結合時，探針的莖環結構改變，熒光基團FAM遠離猝滅基團Dabcyl，使得FAM基團的熒光信號可以被檢測到。基于上述核酸適配體分子信標探針檢測細胞裂解物中組氨酸標簽重組蛋白的方法，包括如下步驟 (1)制備核酸適配體分子信標探針在ABIDNA synthersizer上合成所述的核酸適配體分子信標探針； (2)將待測細胞裂解物加入到含有步驟(I)所述核酸適配體分子信標探針的緩沖溶液中，通過檢測探針熒光強度的變化檢測細胞裂解物中的含組氨酸標簽的重組蛋白。 當溶液中沒有含組氨酸標簽的重組蛋白存在時，核酸適配體分子信標探針為莖環結構，此時FAM基團的熒光信號被Dabcyl基團猝滅；當溶液中存在可以與探針結合的組氨酸標簽重組蛋白時，探針莖部會改變物理結構使得熒光基團FAM遠離猝滅基團Dabcyl，進而使得熒光信號可以被檢測到。下面對本專利技術的探針及檢測方法作進一步的說明 本專利技術的抗組氨酸標記核酸適配體分子信標探針，是一種可以對多種目標進行識別的 新型分子信標。本專利技術選用6H5核酸適配體，其可以特異性識別組氨酸標記蛋白，通過對一系列可能的6H5序列長度及短鏈cDNA的比較最終確定探針結構如下5’ -FAM-CAGGTTGGTCTGGTTGGGTTTGGCTCCTGTGTACG - (CH2CH20) 36-CAACCTG-Dabcyl_3，，其中，CAGGTTGGTCTGGTTGGGTTTGGCTCCTGTGTACG (SEQ ID NO. I)為核酸適配體6H5，即，組氨酸標簽識別序列；核酸片段cDNA CAACCTG (SEQ ID NO. 2)是與核酸適配體6H5中CAGGTTG的互補序列；PEG36為橋聯分子；FAM為六羧基熒光素，作為熒光報告基團；Dabcyl作為猝滅基團。其中核酸適配體分子信標探針中雙鏈互補雜交的能力弱于核酸適配體探針與組氨酸標簽結合的能力。本專利技術檢測細胞裂解物中組氨酸標記蛋白的方法包括如下步驟 (1)制備核酸適配體分子信標探針在ABIDNA synthersizer上合成所述的核酸適配體分子信標探針； (2)取納摩的物質的量的核酸適配體分子信標探針溶于微升結合緩沖溶液中，其最終濃度為25納摩。取一定量該溶液于95度加熱10分鐘后，緩慢冷卻至室溫。于室溫由 Fluorolog spectrophotometer (Jobin Yvon Horiba)記錄該探針的突光強度。往已淬火的探針溶液中加入待測細胞裂解物。室溫孵育一小時后，于室溫由FlUOTOlOgspectrophotometer (Jobin Yvon Horiba)記錄探針溶液的突光變化。利用本專利技術的核酸適配體分子信標探針檢測細胞裂解物中組氨酸標記蛋白的原理如下 當溶液中不存在組氨酸標簽蛋白質時，核酸適配體分子信標探針的部分堿基(CAGGTTG)與cDNA (CAACCTG)雜交形成雙鏈，整個分子呈一種莖環的結構，在這種莖環結構中，FAM熒光基團和猝滅基團Dabcyl相互靠近，因此FAM基團的光信號被Dabcyl基團猝滅；當溶液中有組氨酸標簽蛋白質存在時，核酸適體分子信標探針中整個核酸適體適配體序列參與結合，莖環結構被迫打開，導致熒光基團遠離猝滅基團使得熒光信號恢復。本專利技術具有以下特點 I、探針制備簡單，價格低廉。2、能夠快速檢測并定量分析。3、相較于抗體對蛋白質有更好的親和能力。4、不需蛋白質標記，可以直接檢測細胞裂解液中組氨酸標記蛋白。附圖說明 圖I為核酸適配體分子信標探針的示意圖； 圖2為核酸適配體分子信標探針對P68蛋白和含組氨酸標簽P68重組蛋白的動力學響應 圖3為核酸適配體分子信標探針對不同蛋白質的熒光響應圖；其中，Ftl代表待檢分析物不存在時，探針的熒光強度^代表待檢分析物存在時，探針的熒光強度。其中牛血清蛋白質(BSA*)濃度為10微摩，H6多肽濃度為8微摩，其余蛋白濃度均為200納摩； 圖4為核酸適配體分子信標探針對不同濃度組氨標簽P78重組蛋白熒光響應圖。其中，自下至上濃度分別為0，6.25，13，25，50，100, 200, 400納摩；內插圖為三次重復實驗得出的F/匕和his-P78蛋白濃本文檔來自技高網...

【技術保護點】

【技術特征摘要】
1.一種檢測組氨酸標簽的核酸適配體分子信標探針，其特征在于，所述探針包含SEQID NO. I和SEQ ID NO. 2所示的序列；SEQ ID NO. I所示序列的3’端與SEQ ID NO. 2所示序列的5’端通過PEG36橋聯；SEQ ID NO. I所示序列5’端修飾有熒光基團FAM ；SEQ ID NO. 2所示序列3’端修飾有淬滅基團Dabcyl。2.如權利要求I所述的核酸適配體分子信標探針，其特征在于，當所述核酸適配體分子信標探針未與組氨酸標記蛋白結合時，探針為莖環結構，探針的FAM基團的熒光信號被D...

【專利技術屬性】
技術研發人員：譚蔚泓，張曉兵，譚曉紅，丁玎，
申請(專利權)人：湖南大學，
類型：發明
國別省市：