本發明專利技術屬于動物基因工程技術領域，是一種利用特定引物對牛優良超數排卵性狀相關基因HIF3α基因片段的克隆以及其在牛標記輔助選擇中的應用。所獲得的HIF3α基因片段的核苷酸序列長度為379bp。在此片段的第278bp處存在有一個A→G的堿基突變，導致Alw44I-RFLP酶切多態性的產生。將此突變位點作為一個分子標記，使用限制性內切酶Alw44I檢測此突變位點，并將檢測結果與牛優良超數排卵性狀相關聯。分析結果表明，具有不同基因型的個體的超數排卵性能有顯著的差異。本發明專利技術的特點在于利用特定引物獲得與牛優良超數排卵性狀相關的HIF3α基因部分片段，并利用PCR-RFLP方法對該片段進行多態性分析，為牛的標記輔助選擇提供分子標記及其應用。
Identification method and application of hypoxia inducible factor 3 alpha gene as molecular marker of bovine excellent Superovulation
The invention belongs to the technical field of animal gene engineering, and is the cloning of a specific primer HIF3 gene fragment related to the excellent superovulation trait of cattle, and its application in the marker assisted selection of cattle. The nucleotide sequence length of the obtained HIF3 alpha gene fragment was 379bp. At the site of this fragment, there is a A to G base mutation that results in the generation of Alw44I-RFLP cleavage polymorphisms (278bp). The mutant site was used as a molecular marker and the restriction enzyme Alw44I was used to detect the mutation site, and the results were correlated with the excellent superovulation trait of cattle. The results showed that there were significant differences in superovulation performance among individuals with different genotypes. The invention is characterized with excellent bovine superovulation related traits HIF3 gene fragment by using specific primers, and the polymorphism analysis of this fragment by using PCR-RFLP method and its application to provide molecular markers for marker assisted selection of cattle.
【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于動物基因工程
，具體涉及牛低氧誘導因子3d基因片段的克隆以及其在牛超數排卵性狀標記輔助選擇中的應用。
技術介紹
Mapletoft 等(Mapletoft RJ 等，Assisted reproductive technologies incattle a review. Rev Sci Technol 2005, 24 :393-403)報道,超數排卵在人類及動物胚胎移植領域是最有意義的技術之一，已被應用多年。此技術更是全世界范圍內牛胚胎生產及胚胎移植的重要組成部分。全世界范圍內每年有超過50萬枚胚胎是通過此技術獲得的。在牛胚胎移植過程中，多選擇正常發育的桑葚胚(Morula)檔次以上的可用胚胎(優質的桑葚 胚和囊胚)進行移植。因此，利用此技術獲得更多的可用胚胎，對牛胚胎生產和移植具有重要的意義。Mapletoft 等(Mapletoft R J 等，Recent advances in the superovulationin cattle. Reprod Nutr Dev 2002,42 :601-611)報道，遺傳因素可能是影響超數排卵效果的因素之一。Fauser 等(Fauser B C 等，Predictors of ovarian response progress towards individualized treatment in ovulation induction and ovarianstimulation. Hum Reprod Update 2008,14 :1-14)報道,候選基因的單核苷酸遺傳多態性可能成為預測卵巢反應的首選因素。Maynard M A等報道(Maynard M A等，Multiple splice variants of the humanHIF-3 a locus are targets of the von Hippel-Lindau E3 ubiquitin ligase complex.J Biol Chem. 2003,278 :11032-11040)低氧誘導因子3a (HIF-3 a )在人胎盤和心肌中具有很高的表達量。Genbacev O等報道(Genbacev O等，Human cytotrophoblast expressionof the von Hippel-Lindau protein is down-regulated during uterine invasion insitu and upregulated by hypoxia in vitro. Dev. Biol. 2001,233 :526-536)由于通過母體血液經胎盤提供給胎兒的氧氣量很有限，胚胎便逐漸暴露在低氧環境下，這時HIF-3 α不會再發生降解，并大量聚集在細胞核內發揮生物學作用。Toshiharu Yamashita等(Toshiharu Yamashita 等，Abnormal Heart Development and Lung Remodeling in MiceLacking the Hypoxia-Inducible Factor-Related Basic HeIiχ-Loop-HeIix PAS ProteinNEPAS. Molecular and cellular Biology. 2008,4(28) :1285-1297)也報道，在胚胎和新生兒階段，HIF-3 α表達也發生顯著的變化。Formenti F等(Formenti F等，Regulation ofhuman metabolism by hypoxia-inducible factor. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107(28)12722-12727)證明在哺乳動物中，缺失HIF可以導致胎兒的死亡。同時，其在調節人體新陳代謝中也起著核心作用。因此，低氧誘導因子3a (HIF3A)基因可以被選定為候選基因，其單核苷酸遺傳多態性可能為動物繁殖和生產性能的輔助選擇提供分子標記。
技術實現思路
本專利技術的目的在于克隆牛低氧誘導因子3 α (HIF3A)基因片段，鑒定其特定的突變位點以作為牛優良超數排卵性狀相關基因多態性的檢測方法，為牛標記輔助育種提供一種有意義的分子標記。本專利技術通過以下技術方案實現一種通過特異性引物和PCR(Polymerase Chain Reaction)方法獲得的牛超數排卵性狀相關基因低氧誘導因子3 a (HIF3A)的379bp序列，如表SEQ ID N0:1所示。所獲得HIF3A基因片段的DNA下列中有如表SEQ ID NO : I所述的C278-G278的堿 基突變，導致Alw44I_RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism)多態性的產生。一種篩選適用于牛優良超數排卵性狀相關的分子標記的方法，按照以下步驟制備:通過設計特異性引物一對，正向引物HIF3A-F :5’-CTGGGCAGTTGCTACTGTTCCTAT-3’和反向引物HIF3A-R :5’ -AGTCCCGTCCAGGATTGGT-3’，從牛血液中提取基因組DNA，進行PCR擴增。由于PCR產物片段的DNA序列第278位存在C-G的堿基突變，導致Alw44I_RFLP多態性的產生，利用限制性內切酶Alw44I可進行此突變位點的檢測。PCR產物片段的酶切產物可利用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，將檢測結果所示的不同基因型與牛超數排卵性狀關聯分析。具備特定的基因型的個體將得到更好超數排卵效果O以下對本專利技術作詳細的描述一、牛低氧誘導因子3 a (HIF3A)基因片段的克隆利用生物學軟件01igo6. O設計一對特異性引物。建立PCR反應條件，具體情況如下HIF3A-F 5，-CTGGGCAGTTGCTACTGTTCCTAT-3 ’(正向引物)HIF3A-R 5，-AGTCCCGTCCAGGATTGGT-3 ’(反向引物)為較快地獲得良好的結果，本專利技術選擇Biomiga公司的2XBench Top TaqMaster mix進行PCR擴增。具體反應體系為2XMaster Mix (產品包裝盒內提供，其中含Taq DNA Polymerase 0. 05 units/ μ 1,4mM MgCl2,0. 4mM dNTPs) 10. 0 μ I,正向引物與反向引物(濃度為均為lOpmol/μ I)各0. 5μ 1，基因組DNA 0. 5 μ I (含10_50ngDNA)，二餾水8. 5 μ I。PCR反應條件為94°C預變性5分鐘，94°C變性30秒，60°C退火30秒，72°C延伸30秒，共35個循環，72°C最后延伸5分鐘。二、RLFP診斷方法的建立用引物HIF3A-F和HIF3A-R擴增牛基因組DNA得到379bp的特異擴增片段(SEQID N0:1)。測序結果發現，在該379bp片段中，由于第278bp處存在C —G的突變，從而導致Alw44I酶切位點(G~TGCAC)的產生，其中，278_279bp間為Alw44I酶的多態性切點。PCR擴增產物經Alw44I酶切產生三種基因型本文檔來自技高網...
【技術保護點】
【技術特征摘要】
1.一對用于鑒定牛低氧誘導因子3d (HIF3A)基因片段的特異性引物，其特征在于，所述引物的序列如下 CCR9-F 5，-CTGGGCAGTTGCTACTGTTCCT...
【專利技術屬性】
技術研發人員：張嘉保，姜昊，鄧瓊，余文莉，李樹靜，陳承禎，俞先鋒，袁寶，張國梁，賈麗坤，
申請(專利權)人：吉林大學，北京安伯胚胎生物技術中心，吉林黑毛牛業有限公司，
類型：發明
國別省市：
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