本發(fā)明專利技術(shù)涉及基因工程領(lǐng)域，提供了一種抗除草劑基因表達(dá)盒，該抗除草劑基因表達(dá)盒可在植物的芽部位特異表達(dá)，由leafy基因啟動子、抗除草劑基因和終止子組成。轉(zhuǎn)基因植物在幼芽部位特異表達(dá)cp4EPSPS基因，在噴灑草甘膦時，可顯著降低轉(zhuǎn)基因植物受傷害的程度。擴(kuò)大了轉(zhuǎn)基因植物與雜草之間對除草劑的敏感程度，可以使轉(zhuǎn)基因植物在使用除草劑時受傷害的程度降至最低，提高農(nóng)作物生產(chǎn)能力。
【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及植物基因工程領(lǐng)域，尤其涉及一種能增強(qiáng)幼芽抗除草劑特性的抗除草劑基因表達(dá)盒、帶有該表達(dá)盒的表達(dá)載體及其在培育抗除草劑植物中的應(yīng)用。
技術(shù)介紹
目前最常用的除草劑是草甘膦，它是一種非選擇性除草劑，通常使用量在2.0-5. Okg a. i. /hm2,1971年由Monsanto公司開發(fā)成功，是全球銷售最好的除草劑品種，其作用機(jī)理主要是競爭性抑制莽草酸途徑中5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)的活性。 1996年美國最先開始種植抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆，2008年，全球抗除草劑轉(zhuǎn)基因作物種植面積7900萬公頃，占全部轉(zhuǎn)基因作物播種總面積的69%，其中50%以上是抗草甘膦除草劑品種。EPSPS成為目前應(yīng)用最廣泛的性狀基因。在使用草甘膦的過程中發(fā)現(xiàn)不同的雜草對除草劑的抗性是不同的，噴灑除草劑的量不足時一些野草可以存活下來，但除草劑噴灑劑量過大也會在一定程度上影響農(nóng)作物的生產(chǎn)，甚至造成部分轉(zhuǎn)基因抗除草劑農(nóng)作物死亡。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的在于提供一種抗除草劑基因表達(dá)盒，該抗除草劑基因表達(dá)盒可在植物的芽部位特異表達(dá)。所述表達(dá)盒由leafy基因啟動子、抗除草劑基因和終止子組成。所述leafy基因啟動子的堿基序列如SEQ ID NO 1所示。所述抗除草劑基因?yàn)镋PSPS基因，其堿基序列如SEQ ID NO 2所示。所述終止子為T-nos。本專利技術(shù)的第二個目的在于提供一種帶有抗除草劑基因表達(dá)盒的表達(dá)載體，所述表達(dá)盒由leafy基因啟動子、抗除草劑基因和終止子組成。所述載體進(jìn)一步還包括一個抗除草劑基因表達(dá)盒，所述表達(dá)盒由35S啟動子、抗除草劑基因和終止子組成。所述leafy基因啟動子的堿基序列如SEQ ID NO 1所示。所述抗除草劑基因?yàn)镋PSPS基因，其堿基序列如SEQ ID NO 2所示。所述終止子為T-nos。本專利技術(shù)的第三個目的在于提供抗除草劑基因表達(dá)盒在培育抗除草劑植物中的應(yīng)用。本專利技術(shù)的第四個目的在于提供含有抗除草劑基因表達(dá)盒的表達(dá)載體在培育抗除草劑植物中的應(yīng)用。本專利技術(shù)的技術(shù)路線為I、利用分子生物學(xué)方法根據(jù)植物偏愛密碼子，人工合成EPSPS基因，命名為cp4EPSPS基因；利用分子生物學(xué)方法克隆煙草leafy基因啟動子；2、構(gòu)建幼芽特異表達(dá)cp4EPSPS基因表達(dá)盒，該表達(dá)盒由leafy基因啟動子、cp4EPSPS基因和T-nos終止子組成；3、構(gòu)建包含兩個cp4EPSPS基因表達(dá)盒的表達(dá)載體p3300-leafy-CP4EPSPS-35s_CP4EPSPS，其中一個表達(dá)盒由leafy基因啟動子、cp4EPSPS基因和T_nos終止子組成，另一個表達(dá)盒由35S啟動子、cp4EPSPS基因和T_nos終止子組成；4、將表達(dá)載體p3300-leafy-CP4EPSPS-35s_CP4EPSPS用根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化煙草，獲得芽特異表達(dá)轉(zhuǎn)cp4EPSPS基因煙草，噴灑草甘膦實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證轉(zhuǎn)芽特異表達(dá)cp4EPSPS基因煙草受傷害程度顯著降低。本專利技術(shù)構(gòu)建了含有芽特異表達(dá)cp4EPSPS基因表達(dá)盒的表達(dá)載體，實(shí)驗(yàn)證明轉(zhuǎn)基因植物在幼芽部位特異表達(dá)cp4EPSPS基因，在噴灑草甘膦時，可顯著降低轉(zhuǎn)基因植物受傷害的程度。擴(kuò)大了轉(zhuǎn)基因植物與雜草之間對除草劑的敏感程度，可以使轉(zhuǎn)基因植物在使用除草劑時受傷害的程度降至最低，提高農(nóng)作物生產(chǎn)能力。附圖說明圖I是芽特異表達(dá)抗除草劑基因表達(dá)盒圖譜；圖2 是表達(dá)載體 p3300-leafy-CP4EPSPS-35s_CP4EPSPS 質(zhì)粒圖譜；圖3是轉(zhuǎn)基因煙草PCR檢測電泳圖，M =Marker ;1_8 :為轉(zhuǎn)基因植株；P :為陽性對照；N:為野生型植株負(fù)對照。圖4A是轉(zhuǎn)基因煙草噴灑草甘膦一周后結(jié)果圖，左非轉(zhuǎn)基因煙草，中35S-cp4EPSPS 轉(zhuǎn)化的煙草；右，35S-Cp4_EPSPS+leafy-Cp4EPSPS 轉(zhuǎn)化的煙草。圖4B是轉(zhuǎn)基因煙草噴灑草甘膦三周后結(jié)果圖，左非轉(zhuǎn)基因煙草，中35S-cp4EPSPS 轉(zhuǎn)化的煙草；右，35S-Cp4_EPSPS+leafy-Cp4EPSPS 轉(zhuǎn)化的煙草。具體實(shí)施例方式以下結(jié)合具體實(shí)施例對本專利技術(shù)的技術(shù)路線做進(jìn)一步詳細(xì)說明。實(shí)施例I構(gòu)建幼芽特異表達(dá)cp4EPSPS基因表達(dá)盒利用分子生物學(xué)方法根據(jù)植物偏愛密碼子，人工合成EPSPS基因，命名為cp4EPSPS基因，其堿基序列如SEQ ID NO 2所示；利用分子生物學(xué)方法克隆煙草leafy基因啟動子，其堿基序列如SEQ ID NO 2所示；構(gòu)建幼芽特異表達(dá)cp4EPSPS基因表達(dá)盒，其結(jié)構(gòu)如圖I所示，該表達(dá)盒由leafy基因啟動子、cp4EPSPS基因和T-nos終止子組成。實(shí)施例2構(gòu)建包含兩個cp4EPSPS基因表達(dá)盒的表達(dá)載體請參閱圖2，表達(dá)載體 p3300-leafy-CP4EPSPS-35s_CP4EPSPS，包含兩個 cp4EPSPS基因表達(dá)盒，其中一個表達(dá)盒由leafy基因啟動子、cp4EPSPS基因和T_nos終止子組成，另一個表達(dá)盒由35S啟動子、cp4EPSPS基因和T_nos終止子組成，該表達(dá)載體在市售p3300質(zhì)粒的基礎(chǔ)上進(jìn)行構(gòu)建。實(shí)施例3利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化法獲得轉(zhuǎn)幼芽特異表達(dá)cp4EPSPS基因煙草將植物表達(dá)載體p3300-leafy-CP4EPSPS-35s_CP4EPSPS 轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌 LBA 4404，然后通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤法轉(zhuǎn)化煙草。農(nóng)桿菌侵染后的煙草愈傷，分化得到幼苗，經(jīng)過PPT初篩，得到PPT抗性的植株，部分植株移栽溫室，40天后提取基因組DNA檢測，以基因組DNA為模板，PCR檢測結(jié)果見圖3，為部分轉(zhuǎn)CP4EPSPS基因植株的檢測電泳圖。實(shí)施例4轉(zhuǎn)幼芽特異表達(dá)cp4EPSPS基因煙草生物學(xué)檢測對非轉(zhuǎn)基因煙草，35S_cp4EPSPS轉(zhuǎn)化的煙草和 35S_Cp4-EPSPS+leafy_Cp4EPSPS轉(zhuǎn)化的煙草，同時噴灑草甘膦，觀察其變化，結(jié)果參見圖4A和圖4B。圖4A和圖4B分別是噴灑草甘膦一周后和三周后的結(jié)果，左為非轉(zhuǎn)基因煙草，中為 35S-cp4EPSPS轉(zhuǎn)化的煙草，右為35S_Cp4_EPSPS+lefy-Cp4EPSPS轉(zhuǎn)化的煙草，可以很明顯的看出35S-Cp4-EPSPS+leafy-Cp4EPSPS轉(zhuǎn)化的煙草受傷害程度最輕。擴(kuò)大了轉(zhuǎn)基因植物 與雜草之間對除草劑的敏感程度。本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
【技術(shù)特征摘要】
1.一種抗除草劑基因表達(dá)盒，其特征在于所述表達(dá)盒由leafy基因啟動子、抗除草劑基因和終止子組成。2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種抗除草劑基因表達(dá)盒，其特征在于所述leafy基因啟動子的堿基序列如SEQ ID NO 1所示。3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種抗除草劑基因表達(dá)盒，其特征在于所述抗除草劑基因?yàn)镋PSPS基因，其堿基序列如SEQ ID N0:2所示。4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種抗除草劑基因表達(dá)盒，其特征在于所述終止子為T-noSo5.一種帶有抗除草劑基因表達(dá)盒的表達(dá)載體，其特征在于所述表達(dá)盒由leafy基因啟動子、抗除草劑基因和終止子組成。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種帶有抗除草劑基因表達(dá)盒的表達(dá)載體，其特...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：林忠平，杜娟，胡鳶雷，徐志超，連肖華，
申請(專利權(quán))人：林忠平，
類型：發(fā)明
國別省市：
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