本發明專利技術公開了山羊SH2B1基因單核苷酸多態性位點及其檢測方法，以包含SH2B1基因的待測山羊全基因組DNA為模板，以引物對P1、P2為引物，PCR擴增山羊SH2B1基因，然后進行SSCP多態性的檢測。其基因多態性位點包括：在山羊的SH2B1基因第4356位為T或C的堿基多態性；在山羊的SH2B1基因第6033位為G或A的堿基多態性。本發明專利技術把PCR產物混合測序篩查SNP與PCR-SSCP結合起來解決了SSCP的不穩定性，以防突變位點的漏檢，提供了一種用簡單、快速、低成本、精確度高的，便于推廣應用的在DNA水平上篩查和檢測與山羊生長性狀密切相關的遺傳標記，可用于山羊的輔助選擇和分子育種。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于分子遺傳學領域，涉及基因單核苷酸多態性(SNP)的檢測，特別涉及山羊SH2B1基因單核苷酸多態性位點及其檢測方法。
技術介紹
單核苷酸多態性(SNP)指基因組DNA序列中由于單個核苷酸(A/T/C/G)的替換而引起的多態性，主要由單個堿基的轉換或者顛換所引起。具有轉換型變異的SNPs約占2/3，其他幾種SNP在相似的水平上。CpG 二核苷酸的胞嘧啶是基因組中最易發生突變的位點，其中大多數是甲基化的，可自發地脫去氨基而形成胸腺嘧啶。根據對遺傳性狀的影響，基因多態性又可分為兩種一種是同義突變多態性，即SNP所致編碼序列的改變并不影響其所翻譯的蛋白質中氨基酸序列，突變堿基與未突變堿 基的“含義”相同；另一種是非同義突變多態性，即堿基序列的改變將導致編碼氨基酸的改變，從而產生蛋白質序列的改變，可能最終影響到蛋白質的功能。因此，對編碼區SNPs的非同義突變來說，它們可能對基因功能有直接的重要影響；尤其對于無義密碼子突變來說，更可能會導致所編碼的蛋白發生重大變化，從而影響它的功能發揮，對個體的表現型產生重要影響。不僅如此，在群體遺傳研究中，這些SNPs作為遺傳標記在群體遺傳和生物進化的研究中也具有重要意義。近年來，人們發展了許多用于探尋分子遺傳標記的方法，最常見的有單鏈構象多態技術(SSCP)、PCR-RFLP和直接測序技術等。SSCP可以發現靶DNA片段中未知位置的堿基突變。Takao經實驗證明小于300bp的DNA片段中的單堿基突變，90%可被SSCP發現，他認為現在知道的所有單堿基改變絕大多數可用該方法檢測出來。另外，SSCP方法可通過聚丙烯酰胺凝膠電泳將不同遷移率的突變單鏈DNA分離，并且還可以進一步提純。用這種方法可以最終從DNA序列水平上鑒別突變DNA片段。該方法簡便、快速、靈敏，不需要特殊的儀器。胰島素通過促進骨骼肌和脂肪組織對于葡萄糖的攝取以及抑制肝臟葡萄糖的生成以降低血糖。胰島素與胰島素受體結合并使其活化。胰島素受體酪氨酰(基)使胰島素受體底物(IRS-1，-2，-3，以及-4)磷酸化。IRS蛋白，特別是IRS-I和IRS-2，可以啟動和協調多個下游途徑，包括磷脂酰肌醇3-激酶/Akt信號途徑。Src同源區2 (SH2) B接頭蛋白I (SH2B1 ;原名SH2-B)是接頭蛋白家族的一個成員。SH2B1是一組對于許多種信號通路起作用的銜接子，涉及關于一些受體酪氨酸激酶，包括胰島素受體的信號轉導途徑。SH2B1是一個異常的內源性胰島素致敏物，它能夠直接同時與胰島素，IRS-I以及IRS-2相結合，從而通過促進胰島素受體催化活性和抑制IRS蛋白的酪氨酸脫磷酸作用來增強胰島素敏感性。在肌肉，肝臟，脂肪組織中，SH2B1形成二聚體，SH2B1 二聚體中的每一個SH2B1分子可同時與胰島素受體以及IRS-I (或IRS-2)結合，介導復合體的形成，從而保護IRS蛋白免于酪氨酸脫磷酸化，并刺激胰島素受體的催化活性，從而在整體上激活胰島素受體的下游通路。因此，研究哺乳動物SH2B1基因遺傳變異和分子遺傳特征具有重要理論和實踐意義。目前，對于SH2B1基因遺傳變異的研究較少，著重在小鼠和人類肥胖癥上。國內外關于家畜SH2B1基因遺傳變異的研究，除了最近SH2B1基因SNP與中國黃牛生長性狀之外，目前在山羊中還未見相關報道。由于SH2B1基因對于維持正常體重，胰島素敏感性以及葡萄糖代謝所必需，本專利技術提供的檢測方法為SH2B1基因SNP與體尺性狀關系的建立奠定了基礎，以便用于中國山羊生長性狀的標記輔助選擇(MAS)，快速建立遺傳資源優良的山羊種群。
技術實現思路
本專利技術解決的問題在于利用PCR產物混合測序的方法篩查山羊SH2B1基因的多態性位點，提供了一種山羊SH2B1基因SNP的篩查和檢測方法。通過關聯分析尋找與山羊體尺性狀相關的SNP作為分子標記，以功能SNP作為山羊分子育種和輔助選擇的標記，加快良種選育速度和提聞種群品質。本專利技術是通過以下技術方案來實現 本專利技術根據SH2B1基因的外顯子設計引物，分別以4種山羊品種的基因組DNA為模板，進行PCR擴增，對PCR產物混合并純化，測序后得到山羊SH2B1基因的部分序列。一種山羊SH2B1基因的單核苷酸多態性，其基因多態性包括在山羊的SH2B1基因第4356位為T或C的堿基多態性；在山羊的SH2B1基因第6033位為G或A的堿基多態性。上述山羊SH2B1基因的單核苷酸多態性的檢測方法為以包含SH2B1基因的待測山羊全基因組DNA為模板，以引物對PI、P2為引物，PCR擴增山羊SH2BI基因；所述的引物對Pl為上游引物5’GGCTCAGGCATTCTTGGA 3’下游引物5’CCTTGCTCCTGTTAGGGTTG 3’所述的引物對P2為上游引物5’CCTCCGCTTCAAAGTGCTG 3’下游引物5’GCGGGAGTTCTGCGAGTC 3’所述的PCR擴增的反應程序為95°C預變性4min ;94°C變性45s，58°C退火50s，72°C延伸lmin，32個循環，最后72°C延伸10min，4°C保存。瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產物片段大小，所用的瓊脂糖凝膠的質量濃度為I.0%。用變性劑對PCR擴增產物進行變性處理，再進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，根據聚丙烯酰胺凝膠電泳結果鑒定山羊SH2B1基因是否有多態。 所述的聚丙烯酰胺凝膠的質量濃度為10 %。所述的根據聚丙烯酰胺凝膠電泳結果鑒定山羊SH2B1基因存在多態性，第7內含子4356位點有三種帶型，分別為TT，TC，CC,第9外顯子6033位點有兩種帶型，分別為GG，GA。本專利技術對4個山羊品種上述兩個SNP進行了基因分型和基因頻率分析，同時也對SSCP多態位點與山羊體尺性狀之間進行了關聯分析。與現有技術相比，本專利技術把PCR產物混合測序篩查SNP與PCR-SSCP結合起來解決了 SSCP的不穩定性，以防突變位點的漏檢，提供了一種用簡單、快速、低成本、精確度高的，便于推廣應用的在DNA水平上篩查和檢測與山羊生長性狀密切相關的遺傳標記，可用于山羊的輔助選擇和分子育種。附圖說明I、圖I是引物Pl擴增不同山羊個體(山羊SH2B1基因第4356位多態位點)PCR產物瓊脂糖凝膠電泳圖；2、圖2是引物P2擴增不同山羊個體(山羊SH2B1基因第6033位多態位點)PCR產物瓊脂糖凝膠電泳圖；3、圖3是本專利技術中PCR產物混合測序篩查到的山羊SH2B1基因序列第4356位T-C突變測序結果圖；4、圖4是本專利技術中PCR產物混合測序篩查到的山羊SH2B1基因序列第6033位G-A 突變測序結果圖；5、圖5是本專利技術山羊SH2B1基因第4356位多態位點聚丙烯酰胺凝膠電泳圖；6、圖6是本專利技術山羊SH2B1基因第6033位多態位點聚丙烯酰胺凝膠電泳圖。具體實施例方式為使本專利技術的技術方案便于理解，以下結合具體實施例對本專利技術作進一步的說明。本專利技術根據SH2B1基因的保守序列設計引物，分別以4個山羊群體的基因組DNA為模板，進行PCR擴增，混合PCR產物并對其純化，測序。然后，進行測序圖分析和序列比對篩查出SNP位點；其次，對待測群體進行多態位點的PCR-SSCP檢測；最后，根據在群體中檢測到的基因型，進行群體遺傳統計分析和體尺性狀本文檔來自技高網...
【技術保護點】
【技術特征摘要】
1.山羊SH2B1基因單核苷酸多態性位點，其特征在于所述基因單核苷酸多態性位點包括 在山羊的SH2B1基因第4356位為T或C的堿基多態性位點； 在山羊的SH2B1基因第6033位為G或A的堿基多態性位點。2.一種檢測山羊SH2B1基因單核苷酸多態性位點的方法，其特征在于，包括以下步驟 (1)、以包含SH2B1基因的待測山羊全基因組DNA為模板，以引物對Pl和P2為引物，PCR擴增山羊SH2B1基因； 所述的引物對Pl為 上游引物5’ GGCTCAGGCATTCTTGGA 3’ 下游引物5’ CCTTGCTCCTGTTAGGGTTG 3’ 所述的引物對P2為 上游引物5’ CCTCCGCTTCAAAGTGCTG 3’ 下游引物5’ GCGGGAGTTCTGCGAGTC 3’ (2)、對步驟(I)的擴增產物進行PCR產物的切膠...
【專利技術屬性】
技術研發人員：陳宏，劉宣宣，房興堂，張春雷，
申請(專利權)人：江蘇師范大學，
類型：發明
國別省市：
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