檢測四環(huán)素類抗生素的試劑盒制造技術(shù)

本實用新型專利技術(shù)提供了一種檢測四環(huán)素類抗生素的試劑盒，包括凍干有四環(huán)素類藥物單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物的微孔試劑條和試紙條，試紙條由底板、附著在底板上依次緊密相連的樣品吸收墊、反應(yīng)膜、吸水墊和保護膜組成，所述反應(yīng)膜上具有包被有四環(huán)素半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物構(gòu)成的檢測線印跡“|”和包被羊抗鼠抗抗體構(gòu)成的質(zhì)控線印跡“|”。本實用新型專利技術(shù)試劑盒具有便攜性好，靈敏度高，檢測時間短等特點，可以在四環(huán)素類抗生素殘留檢測中發(fā)揮重要作用。（*該技術(shù)在2021年保護過期，可自由使用*）

【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】

本技術(shù)涉及一種檢測牛奶中四環(huán)素類抗生素的試劑盒。
技術(shù)介紹
四環(huán)素類藥物具有廣譜高效的殺菌抗生功效，可以與大多數(shù)藥物或飼料添加劑混用，已被廣泛應(yīng)用于畜禽生產(chǎn)中。但四環(huán)素類藥物過量使用不可避免的造成了嚴(yán)重的藥物殘留，成為嚴(yán)重危害人類健康的食品安全隱患之一。為此世界各國對四環(huán)素類藥物殘留的檢測十分關(guān)注。歐盟第675/92號令中初步規(guī)定在肌肉及牛奶中的四環(huán)素類化合物的總量不得超過100μ g/kg，在腎臟，肝臟及雞蛋中分別不得超過600μ g/kg、300l·! g/kg 及200yg/kg。日本肯定列表制度規(guī)定奶和雞蛋中四環(huán)素類化合物的總量分別不得超過 100ng/mL 和 400ng/mg。關(guān)于四環(huán)素類藥物殘留的檢測方法有微生物法、薄層色譜法、高效液相測定法、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法、毛細(xì)管電泳、電化學(xué)分析、化學(xué)發(fā)光、酶聯(lián)免疫法、膠體金免疫法等，儀器檢測方法對待測樣品的前處理要求高，操作煩瑣，需要精密儀器設(shè)備。免疫學(xué)方法具有快速、靈敏、特異性高等特點，是四環(huán)素類藥物殘留檢測的有效方法之一。
技術(shù)實現(xiàn)思路
本技術(shù)的目的是提供一種靈敏度高、成本低、操作簡單、檢測時間短的檢測四環(huán)素類抗生素的試劑盒。本技術(shù)的試劑盒，其包括凍干的四環(huán)素類藥物單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物的微孔試劑條和試紙條，試紙條由底板、附著在底板上依次緊密相連的樣品吸收墊、反應(yīng)膜、 吸水墊和保護膜組成，所述反應(yīng)膜上具有包被有四環(huán)素半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物構(gòu)成的檢測線印跡“ I ”和包被羊抗鼠抗抗體構(gòu)成的質(zhì)控線印跡“ I ”。樣品吸收墊位于底板始端， 吸水墊位于底板末端，檢測線和質(zhì)控線平行，質(zhì)控線位于距離吸水墊始端與反應(yīng)膜相連處 5-8mm處，檢測線位于距離質(zhì)控線5_6mm處。試紙條樣品吸收墊上檢測端粘貼有保護膜，保護膜上有MAX標(biāo)記線，微孔試劑條的反應(yīng)孔上具有微孔塞。為了便于運輸和使用，試劑盒還有固定用具及固定于其中用于盛裝微孔試劑條和試紙條的試劑桶，所述試劑桶上具有密封蓋。本技術(shù)試劑盒中試紙條底板可為PVC底板或其他硬質(zhì)不吸水的材料；樣品吸收墊可為吸濾紙或濾油紙；吸水墊為吸水紙；反應(yīng)膜可為硝酸纖維素膜或醋酸纖維素膜； 保護膜為PE材質(zhì)保護膜；試劑盒盒體為硬紙盒；試劑桶為塑料試劑桶；固定用具為硬質(zhì)支撐材料。本技術(shù)試劑盒具有如下有益效果I.靈敏度高。四環(huán)素類抗生素檢測試劑盒以膠體金標(biāo)記高親和力的單克隆抗體為基礎(chǔ)制備而成，金標(biāo)抗體中金顆粒與抗體分子之間無價健形成，二者通過異性電荷間的范德華力相結(jié)合，膠體金對單克隆抗體特異性和親和力影響很小，且具有較高的標(biāo)記率。其中的四環(huán)素類藥物單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物凍干在微孔試劑條中，在檢測過程中，能夠使金標(biāo)抗體與待檢樣品液充分接觸，充分反應(yīng)，從而減少誤差，增加整個體系的反應(yīng)靈敏度。因此，本技術(shù)試劑盒具有較高的特異性和靈敏度。本試劑盒對四環(huán)素、強力霉素、金霉素、土霉素檢測靈敏度分別為40 μ g/L、40 μ g/L、40 μ g/L、80 μ g/Lo2.操作簡便快速。使用試劑盒檢測時無需任何其它試劑，只要將待檢樣品溶液滴加于微孔試劑中，混勻后，孵育5min，將試紙標(biāo)有MAX線標(biāo)記端向下，插入孵育后的微孔試劑后計時，5min內(nèi)觀察結(jié)果。3.顯示檢測結(jié)果形象、直觀準(zhǔn)確。檢測是試紙條以顯示紅線色“ I ”及“ Il ”印跡作為陽性和陰性標(biāo)記，即在硝酸纖維素膜上顯示一條紅線“ I ”印跡表示在被檢測樣本液中四環(huán)素類抗生素的含量高于等于試劑盒對四環(huán)素類抗生素藥物的最低檢測限，兩條紅線“ Il ”印跡表示在被檢測樣本中四環(huán)素類抗生素含量低于試劑盒對四環(huán)素類抗生素藥物的最低檢測限，結(jié)果判定形象、直觀、準(zhǔn)確、簡單明了，不容易出現(xiàn)結(jié)果誤判。4.成本低，投資少。使用本技術(shù)試劑盒，不需另配儀器設(shè)備及其他試劑，使現(xiàn) 場檢測一步到位，成本低廉，投資少，見效快。5.易于大范圍推廣應(yīng)用。試劑盒操作簡單，能較好滿足乳品檢測的需求，具有廣闊的市場前景和較大的經(jīng)濟、社會效益。附圖說明圖I為本技術(shù)試紙條結(jié)構(gòu)示意圖；圖2為本技術(shù)試紙條俯視圖；圖3為本技術(shù)微孔試劑圖；圖4a、4b、4c、4d為本技術(shù)試紙條檢測結(jié)果判定圖；圖5為本技術(shù)試劑桶結(jié)構(gòu)示意圖；圖6為本技術(shù)固定用具的俯視圖；圖7為本技術(shù)盒體與固定用具的側(cè)視圖。具體實施方式一、四環(huán)素類抗生素檢測試劑盒的組裝制備I)試紙條樣品吸收墊I、反應(yīng)膜2、吸水墊3和保護膜7依次按順序黏貼在所述底板6上，樣品吸收墊位于底板始端，吸水墊位于底板末端，樣品吸收墊的末端與反應(yīng)膜始端相連，反應(yīng)膜的末端與吸水墊相連，樣品吸收墊的始端與底板的始端對齊，吸水墊的末端與底板的末端對齊，試紙樣品吸收墊上檢測端粘貼有保護膜，保護膜上印有MAX標(biāo)記線，檢測線4包被有四環(huán)素半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物，質(zhì)控線5包被有羊抗鼠抗抗體。底板為PVC底板，樣品吸收墊為吸濾紙，反應(yīng)膜為硝酸纖維素膜，吸水墊為吸水紙，保護膜為PE材質(zhì)保護膜。2)微孔試劑條微孔試劑條8具有微孔塞9，孔中凍干有四環(huán)素類藥物單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物。3)將I)試紙條和2)微孔試劑條裝入具有密封蓋的塑料試劑桶10，將塑料試劑桶放置于試劑盒盒體12內(nèi)的固定用具11中。二、試劑盒的使用待檢牛奶樣品溶液滴加200 μ I到微孔試劑中，混勻后，孵育5min，將試紙標(biāo)有MAX 線標(biāo)記端向下，插入孵育后的微孔試劑后計，5min內(nèi)觀察結(jié)果。三、檢測結(jié)果分析四環(huán)素類抗生素在樣本中的含量高于等于試劑盒對其的最低檢測限時，四環(huán)素類藥物單克隆-膠體金標(biāo)記物與四環(huán)素類抗生素結(jié)合，金標(biāo)抗體上的抗原結(jié)合位點被封閉， 從而在檢測區(qū)內(nèi)因為競爭反應(yīng)，不會與四環(huán)素半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物結(jié)合而不出現(xiàn)紅色條帶。陰性樣本在檢測過程中由于缺少抗原抗體競爭反應(yīng)，將會在檢測線和質(zhì)控線上出現(xiàn)紅色條帶。如圖4所示。陽性當(dāng)質(zhì)控線(C)顯示一條紅色條帶，而檢測線(T)不顯色，試紙條以顯示紅線色“ I ”，判為陽性，如圖4a圖所示。陰性當(dāng)質(zhì)控線(C)顯示一條紅色條帶，檢測線(T)同時也顯示出一條紅色條帶， 試紙條以顯示紅線色為“ Il ”，判為陰性，如圖4b所示。無效當(dāng)質(zhì)控線(C)不顯示出紅色條帶，則無論檢測線(T)顯示出紅色條帶與否， 該試紙條判為無效，如圖4c、4d所示。四、檢測試劑盒中用到的材料制備方法I、四環(huán)素半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物的合成與鑒定四環(huán)素類藥物是小分子物質(zhì)，只有免疫反應(yīng)性，沒有免疫原性，不能誘發(fā)機體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，必須與大分子載體蛋白偶聯(lián)后才具有免疫原性。(I)四環(huán)素半抗原的制備取I. I g四環(huán)素，O. 37 g 4-哌啶甲酸，2 ml 37%甲醛，在50 ml乙醇中混合，在 60%微波強度下反應(yīng)3-5分鐘；除去溶劑后，反相柱層析分離，得到黃色固體。(2)免疫原的制備將四環(huán)素半抗原與牛血清白蛋白(BSA)偶聯(lián)得到免疫原，具體步驟方法如下I)取IOmg四環(huán)素半抗原用Iml 二甲基甲酰胺(DMF)溶解,冷卻至10 °C,加入 10 μ I氯甲酸異丁酯，10°c攪拌反應(yīng)30min，得到溶液A ；2)取 40mg BSA 用 3ml 50mmol/L Na2CO3 溶解，與溶液 A 混合，10°C 反應(yīng) 4h，然后 4°C過夜，得到反應(yīng)液B ;3)將反應(yīng)液B本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護點】

【技術(shù)特征摘要】
1.一種檢測四環(huán)素類抗生素的試劑盒，其特征在于包括凍干有四環(huán)素類藥物單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物的微孔試劑條和試紙條，試紙條由底板、附著在底板上依次緊密相連的樣品吸收墊、反應(yīng)膜、吸水墊和保護膜組成，所述反應(yīng)膜上具有包被有四環(huán)素半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物構(gòu)成的檢測線印跡“ I ”和包被羊抗鼠抗抗體構(gòu)成的質(zhì)控線印跡“ I ”。2.如權(quán)利要求I所述的試劑盒，其特征在于所述檢測線和質(zhì)控線平行，均呈與試紙條的長相垂直的條帶狀。3.如權(quán)利要求I或2所述的試劑盒，其特征在于所述樣品吸收墊位于底板始端，所述吸水墊位于底板末端，所述質(zhì)控線位于距離吸水墊始端與反應(yīng)膜相連處5-8mm，所述檢測線位于距離質(zhì)控線5-6mm。4.如權(quán)利要求I所述的試劑...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：何方洋，萬宇平，馮月君，趙正苗，陳煒玲，余厚美，劉福林，張荃，
申請(專利權(quán))人：北京勤邦生物技術(shù)有限公司，
類型：實用新型
國別省市：