本發明專利技術提供的一種通過微衛星標記檢測陶賽特羊早期生長發育的方法，包括1）依據第五代綿羊基因圖譜，發現位于綿羊18號染色體末端93.9cM位置的微衛星標記UMP；2）人工合成一對核苷酸序列作為檢測微衛星標記UMP基因型的引物，其正向引物：5'-CTTCCTCATTGGACTTAGCTGCTT-3'；反向引物：5'-GAGCCTGGTGAGCTGCTGTCTAT-3'；上下游引物長度分別為24bp和23bp；3）采集陶賽特羊血液，提取基因組DNA，利用引物擴增PCR，以凝膠成像確定已擴增的目的條帶；4）利用熒光標記的PCR引物對多態位點進行擴增并確定擴增片段的長度，實現對微衛星多態位點的分型，確定陶賽特羊微衛星標記UMP的基因型分別是104/110，107/110，104/107，110/110，104/104，107/107。檢測確定微衛星標記UMP不同基因型個體間的生長發育差別，用于輔助選擇育種。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術設計綿羊18號染色體末端微衛星標記UMP基因型，分型檢測方法，可以快速高效預測陶賽特羊早期生長發育性狀，建立了該微衛星標記基因型分型的檢測方法。
技術介紹
1983年，在美國的無角陶賽特羊群體中發現了一只后臀極度發達的個體，人們稱這種表型為雙肌臀性狀，根據表型將該基因命名為Callipyge (CLPG)基因，20世紀末，人們將CLPG基因初歩定位于陶賽特羊第18號染色體的末端區域，位于微衛星標記CSSM18和TGLA122 之間。文獻檢索披露I)Journal of Animal Science, 76(1998), 2549- 2559，作者Freking等研究發現CLPG基因可顯著提高雙肌臀羊的瘦肉率，也使皮下肌間、肌內和腎周的脂肪減少，能顯著提高屠宰率。2)GenetiCS，163(2003)，453-456，作者Maria等研究發現在CLPG基因內的DLKl和GTL2位點間存在ー處堿基突變(A-G)可以決定CLPG表型。3)國內南京農業大學劉國慶等研究陶賽特羊和薩?？搜蚣捌潆s交后代CLPG基因多態性，發現18號染色體Meg3. 9位點與肉羊后臀肌肉發達的表型相關，詳見論文《遺傳》，28 (2006)，815-820。4)《遺傳》，28 (2006)，1525-1531，作者任航行等分析了與CLPG基因連鎖相關的 10 個微衛星基因座((ILSTS54、TGL A337、HH47、TGLA122、BP33、0B2、BM3413、MCM38、MC MA26和CSSM1)等分別對陶賽特羊和薩?？搜蛉后w的遺傳進行了分析，結果顯示在陶賽特群體中，微衛星BM3413、MCMA26和CSS M18對臀寬有顯著影響；薩?？巳后w中微衛星基因座TGLA122、BM3413、MCM38和CSSM18對綿羊臀寬存在顯著或極顯著影響。隨著測序技術的發展，綿羊基因遺傳連鎖圖譜也在不斷的完善和増加。2010年10月6日第五代綿羊連鎖圖譜發布，該圖譜包含了染色體上的673個DNA標記，連鎖群的總遺傳長度已經超過3000cMo本專利技術研究位于綿羊18號染色體末端UMP微衛星基因座的多態性，在陶賽特羊上發現其微衛星基因座的多態性與早期生長發育具有相關性，可以將該微衛星位點作為影響陶賽特羊早期生長發育的分子標記。
技術實現思路
本專利技術的目在于提供通過綿羊18號染色體末端的微衛星標記UMP快速檢測陶賽特羔羊生長發育性能的方法，對預測陶賽特羊的生長發育速度及性能有著重要的科學價值與實踐意義。本專利技術的目是這樣實現的ー種通過微衛星標記檢測陶賽特羊早期生長發育的方法，包括I)依據第五代綿羊基因圖譜，發現位于綿羊18號染色體末端93. 9cM位置的微衛星標記UMP ；2)人工合成一對核苷酸序列作為檢測微衛星標記UMP基因型的引物，其正向引物5，- CTTCCTCATTGGACTTAGCTGCTT -3，；反向引物5，- GAGCCTGGTGAGCTGCTGTCTAT-3’ ；上下游引物長度分別為24bp和23bp ；3)采集陶賽特羊血液，提取基因組DNA，利用引物擴增PCR，以凝膠成像確定已擴增的目的條帶；4)利用熒光標記的PCR引物對多態位點進行擴增并確定擴增片段的長度，實現對微衛星多態位點的分型，確定陶賽特羊微衛星標記UMP 的基因型分別是 104/110,107/110,104/107,110/110,104/104，107/107 ； 其中綿羊基因組DNA體外擴增 采集羊外周血液I. 5ml，使用肝素納抗凝采血管，-20°C冷凍保存，提取基因組DNA ； 其中綿羊血液基因組DNA的制備 (1)取出-20°C冷凍血液O.5-1.0 ml，在室溫下完全融化，于10000 r/min離心10分鐘，棄去上層液，中含裂解的紅細胞；加入Iml紅細胞裂解液，彈起管底沉淀，輕柔的搖勻10分鐘，于10000 r/min離心10分鐘，棄去上層液；再加入Iml紅細胞裂解液，彈起管底沉 淀，輕柔的搖勻10分鐘，于10000 r/min離心10分鐘,棄去上層液； (2)向管內依次加入600μ1的白細胞裂解液，70ul的10%SDS溶液，15ul濃度為20mg/mL的蛋白酶K溶液和3 ul濃度為10mg/mL的Rnase A溶液，彈起管底沉淀，輕柔的搖勻；置于55°C振蕩水浴鍋中振蕩過夜； (3)取出混合液將其冷卻至室溫，向管內加入600ulTris-HCl飽和酚溶液，將兩相上下輕柔顛倒混勻5分鐘，于10000 r/min離心10分鐘；用直徑為O. 2-0. 35cm的Iml槍頭將上層清液吸出600ul-650ul，移至另一新的滅菌離心管中，加入酚氯仿比為1:1的混合溶液600ul，輕柔的搖勻10分鐘，于10000 r/min離心10分鐘；再用直徑大小為O. 25-0. 38cm的Iml槍頭將上層清液吸出490-520ul，移至另一新的滅菌離心管中，加入氯仿溶液600ul，輕柔的搖勻10分鐘，于10000 r/min離心10分鐘；第三次用直徑為O. 28-0. 37cm的Iml槍頭將上層清液小心吸出300-350ul，移至另一新的滅菌離心管中，加入無水こ醇1ml，輕柔的搖勻2分鐘，可看到漂浮的絮狀物即為DNA，于10000 r/min離心10分鐘； (4)將管內的上清混合液棄去，加入70%酒精200ul，彈起管底DNA沉淀，于10000r/min離心5分鐘；將管內的上清液棄去，放置于超凈工作臺上晾干； 向管內加入超純滅菌水50ul，將干燥的DNA彈起混勻，室溫或4°C保存直至DNA完全溶解； (5)用分光光度計來檢測基因組DNA的濃度和純度，提取血樣基因組DNA，其純度，在I. 6-1. 8 ； (6)用O.8%的瓊脂糖凝膠，檢測提取好的基因組DNA原液的質量； (7)對每ー樣品的DNA進行相應倍數的調整，使濃度達到45-52ng /uL,作為PCR反應的模版，其余的-20°C保存備用； 其中 PCR 擴增反應體系2. 5 yL 的 10XPCR buffer, 2. OuL 的 25mmol/L MgCl，O. 5μ L 的 10 mmol/L dNTP 混合物，I μ L 的 10 μ mol/L 上游引物，I μ L 的 10 μ mol/L 下游引物，1.25U的Taq酶，I μ的50ng/μ L綿羊基因組DNA L，無菌去離子水補足25 μ L ; 其中PCR反應循環程序95 V 5min I個循環；95 °C變性30s，58°C退火30 S，72 V延伸30 s共35個循環；72で延伸6 min I個循環； 其中微衛星分型標記的檢測步驟 (1)將進行PCR反應的96孔板置于冰水混合物上； (2)將96孔板置于平板離心機中，離心2000g即停； (3)使用美國ABI公司的3730XL測序列分析儀檢測微衛星樣本，確定陶賽特羊的微衛星標記UMP基因型；將其不同的基因型作為陶賽特羊早期生長發育速度及特性的分子標記，用于輔助選擇育種； 其中實驗液體的配制 紅細胞裂解液將NH4C1 8. 29g, KHC03 I. Og和EDTA O. 37 g，溶解于800ml去離子水中，定溶至1L，高壓滅菌； 本文檔來自技高網...
【技術保護點】
【技術特征摘要】
1.ー種通過微衛星標記檢測陶賽特羊早期生長發育的方法，其特征在干包括I)依據第五代綿羊基因圖譜，發現位于綿羊18號染色體末端93. 9cM位置的微衛星標記UMP ；2)人工合成一對核苷酸序列作為檢測微衛星標記UMP基因型的引物，其正向引物5’-CTTCCTCATTGGACTTAGCTGCTT -3，；反向引物5，- GAGCCTGGTGAGCTGCTGTCTAT -3，；上下游引物長度分別為24bp和23bp ；3)采集陶賽特羊血液，提取基因組DNA，利用引物擴增PCR，以凝膠成像確定已擴增的目的條帶；4)利用熒光標記的PCR引物對多態位點進行擴增并確定擴增片段的長度，實現對微衛星多態位點的分型，確定陶賽特羊微衛星標記UMP的基因型分別是 104/110,107/110,104/107,110/110,104/104，107/107 ； 其中綿羊基因組DNA體外擴增 采集羊外周血液I. 5ml，使用肝素納抗凝采血管，-20°C冷凍保存，提取基因組DNA ；· 其中綿羊血液基因組DNA的制備 (1)取出-20°C冷凍血液O.5-1.0 ml，在室溫下完全融化，于10000 r/min離心10分鐘，棄去上層液，中含裂解的紅細胞；加入Iml紅細胞裂解液，彈起管底沉淀，輕柔的搖勻10分鐘，于10000 r/min離心10分鐘，棄去上層液；再加入Iml紅細胞裂解液，彈起管底沉淀，輕柔的搖勻10分鐘，于10000 r/min離心10分鐘,棄去上層液； (2)向管內依次加入600μI的白細胞裂解液，70ul的10% SDS溶液，15ul濃度為20mg/mL的蛋白酶K溶液和3 ul濃度為10mg/mL的Rnase A溶液，彈起管底沉淀，輕柔的搖勻，置于55°C振蕩水浴鍋中振蕩過夜； (3)取出混合液將其冷卻至室溫，向管內加入600ulTris-HCl飽和酚溶液，將兩相上下輕柔顛倒混勻5分鐘，于10000 r/min離心10分鐘；用直徑為O. 2-0. 35cm的Iml槍頭將上層清液吸出600ul-650ul，移至另一新的滅菌離心管中，加入酚氯仿比1:1的混合溶液600ul，輕柔的搖勻10分鐘，于10000 r/min離心10分鐘；再用直徑為O. 25-0. 38cm的Iml槍頭將上層清液吸出490-520ul，移至另一新的滅菌離心管中，加入氯仿溶液600ul，輕柔的搖勻10分鐘，于10000 r/min離心10分鐘；第三次用直徑為O. 28_0. 37cm的Iml槍頭將上層清液吸出300-350ul，移至另一新的滅菌離心管中，加入無水こ醇1ml，輕柔的搖勻2分鐘，可看到漂浮的絮狀物即為DNA，于10000 r/min離心10分鐘； (4)將管內的上清混合液棄去，加入70%酒精200ul，彈起管底DNA沉淀，...
【專利技術屬性】
技術研發人員：史洪才，牛志剛，楊丹，梁慶玲，劉明軍，
申請(專利權)人：新疆維吾爾自治區畜牧科學院中國澳大利亞綿羊育種研究中心，
類型：發明
國別省市：
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