梅花SSR遺傳圖譜的構(gòu)建方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)提供了梅花SSR遺傳圖譜的構(gòu)建方法，其是基于梅花全基因組序列信息開發(fā)出SSR引物組的引物序列和擴增方法，所述引物組包含670對SSR引物，并從中篩選出144對核心引物組，用于構(gòu)建梅花遺傳圖譜。本發(fā)明專利技術(shù)建立了梅花的SSR分子標(biāo)記技術(shù)體系，獲得的SSR核心引物組能夠反映出其穩(wěn)定性、共顯性，在基因組中普遍存在，便于統(tǒng)計等優(yōu)點。利用該套標(biāo)記可以進行梅花遺傳圖譜的構(gòu)建、遺傳多樣性分析、品種鑒定和分子標(biāo)記輔助育種等研究，推動梅花遺傳學(xué)和基因組學(xué)的發(fā)展。

【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)涉及分子生物學(xué)、遺傳學(xué)和基因組學(xué)領(lǐng)域，具體地說，涉及梅花SSR遺傳圖譜的構(gòu)建方法。
技術(shù)介紹
梅花(Prunus mume Sieb. et Zucc.)屬于薔薇科李屬，原產(chǎn)于我國川、滇、藏、貴等地區(qū)，已有3000多年的栽培歷史，是我國重要的木本觀賞花卉。但是由于缺乏大量的多態(tài)性分子標(biāo)記，其遺傳學(xué)和基因組學(xué)方面的研究滯后于薔薇科其他植物。目前在木本觀賞花卉的遺傳學(xué)分析中，應(yīng)用較多的主要是RAPD、ISSR、AFLP等分子標(biāo)記，但是這些標(biāo)記大多是采用無全基因組序列信息的技術(shù)開發(fā)得到，雖然具有一定的應(yīng)用價值，但是隨機性強、穩(wěn)定性差。而簡單重復(fù)序列(simple sequence repeat, SSR)標(biāo)記,也稱為微衛(wèi)星DNA(Macrosatellite)，是ー種由1_6個核苷酸為單位多次串聯(lián)重復(fù)的長達幾十甚至幾百個核苷酸的序列。由于SSR標(biāo)記具有重復(fù)性好、穩(wěn)定性強、多態(tài)性高、共顯性遺傳和在基因組中普遍存在等優(yōu)點，廣泛應(yīng)用于植物遺傳圖譜的構(gòu)建、品種鑒定、遺傳多樣性分析、DNA指紋圖譜的構(gòu)建和分子標(biāo)記輔助育種等研究。隨著測序技術(shù)的發(fā)展和成本的降低，許多的植物均已完成全基因組測序，在此基礎(chǔ)上便于對這些植物進行全基因組SSR標(biāo)記的挖掘和分析。由于將基因組的所有SSR位點對備選材料進行逐個分析，需要耗費大量的人力和物力，所以在小麥、甘藍、棉花和玉米等作物中采用核心引物(全基因組染色體上均勻覆蓋并且多態(tài)性、穩(wěn)定性、重復(fù)性等綜合特征好、可作為初步研究優(yōu)先選用的ー套引物)進行研究，有助于提聞SSR技術(shù)的檢測效率。因此開發(fā)基于梅花全基因組序列的SSR核心引物組，有助于高效的構(gòu)建梅花的遺傳圖譜，開展與重要觀賞性狀相關(guān)的QTL定位，從而推動梅花分子標(biāo)記輔助育種的進程。
技術(shù)實現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的是提供ー種梅花SSR遺傳圖譜的構(gòu)建方法。本專利技術(shù)的另一目的是提供一套基于梅花全基因組序列開發(fā)的SSR引物組。本專利技術(shù)的再一目的是提供一套基于梅花全基因組序列開發(fā)的SSR核心引物組。為了實現(xiàn)本專利技術(shù)目的，本專利技術(shù)的ー種梅花SSR遺傳圖譜的構(gòu)建方法，包括以下步驟1)提取待測梅花親本與子代的基因組DNA ;2)利用生物學(xué)軟件，在梅花全基因組序列中，挖掘1-6個核苷酸重復(fù)單元的SSR標(biāo)記，并分別針對這些SSR標(biāo)記設(shè)計SSR引物；3)分別利用上述SSR引物，各自以待測梅花親本和子代的基因組DNA為模版，進行PCR擴增；4)利用生物學(xué)軟件分析PCR擴增結(jié)果，構(gòu)建出梅花SSR遺傳圖譜。前述方法中，所述待測梅花親本是以梅花品種‘粉瓣’為母本，以‘扣子玉蝶’為父本。前述方法中，步驟2)中挖掘1-6個核苷酸重復(fù)單元的SSR標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)為單核苷酸重復(fù)單元最小的重復(fù)長度為10bp，二核苷酸到四核苷酸重復(fù)單元最小的重復(fù)長度為12bp，五核苷酸重復(fù)單元最小的重復(fù)長度為15bp，六核苷酸重復(fù)單元最小的重復(fù)長度為18bp0前述方法中，步驟2)中設(shè)計的SSR引物如序列表中所示的670對引物，優(yōu)選序列表中所示的144對核心引物。 前述方法中，步驟3)中進行PCR擴增反應(yīng)之前，分別用FAM、HEX和TEMRA三種熒光對序列表中所示的144對核心引物的上游引物進行熒光標(biāo)記。前述方法中，所述步驟4)為利用生物學(xué)軟件分析PCR擴增結(jié)果，利用卡平方檢驗作圖群體符合孟德爾期望分離比為I : 2 : 1、1 : I或I : I : I : I的標(biāo)記，P <0.05，過濾掉SSR標(biāo)記中偏分離的標(biāo)記，構(gòu)建出梅花SSR遺傳圖譜。具體地，本專利技術(shù)提供的基于梅花全基因組序列開發(fā)的SSR引物及其應(yīng)用的方法，其包括如下步驟 I、構(gòu)建梅花Fl代擬測交群體；2、對父母本及其190個子代進行基因組DNA的提取；3、利用MISA軟件，在梅花全基因組序列中，挖掘1-6個核苷酸重復(fù)單元的SSR標(biāo)記；4、從中隨意挑選出670個含有SSR標(biāo)記的核苷酸序列，利用Primer 3. O軟件設(shè)計670對SSR引物(如序列表所示);5、利用上述引物在父母本及6個子代中進行核心引物組的篩選，綜合考慮引物重復(fù)性、擴增條帶清晰度等因素，最終確定144對引物為梅花核心引物組(如序列表中所示核心引物)，可用于構(gòu)建梅花SSR遺傳圖譜；6、將所獲得的144對核心引物組分別用FAM、HEX和TEMRA三種熒光對其上游引物進行熒光標(biāo)記；7、利用熒光標(biāo)記的SSR引物，對父母本及其190個子代進行PCR的擴增，在ABI3730DNA自動測序儀上對擴增產(chǎn)物進行檢測，利用GENEMAPPER 3. 7進行圖像的分析和數(shù)據(jù)的收集；8、利用Joinmap4. I軟件對數(shù)據(jù)的統(tǒng)計結(jié)果進行分析，利用卡平方檢驗作圖群體是否符合孟德爾期望分離比為I : 2 : 1、1 : I或I : I : I : I的標(biāo)記，P < O. 05，過濾掉SSR分子標(biāo)記中偏分離的標(biāo)記，利用JoinMap4. I的軟件，設(shè)置LOD值彡3，構(gòu)建梅花SSR遺傳圖譜。利用本專利技術(shù)的基于梅花全基因組序列開發(fā)的670對SSR分子標(biāo)記引物如序列表所示，在以梅花品種‘粉瓣’為母本，以‘扣子玉蝶’為父本進行雜交，構(gòu)建F1代擬測交群體中，篩選出144對SSR引物核心組，分別對其上游引物進行FAM、HEX和TEMRA三種熒光的標(biāo)記，然后在ABI3730DNA自動測序儀上對擴增產(chǎn)物進行檢測，利用GENEMAPPER 3. 7進行圖像的分析和數(shù)據(jù)的收集，最后利用Joinmap4. I軟件對數(shù)據(jù)的統(tǒng)計結(jié)果進行分析，構(gòu)建梅花SSR遺傳圖譜(圖I)。利用本專利技術(shù)的梅花SSR核心引物組可以進行梅花遺傳圖譜的構(gòu)建、遺傳多祥性分析、品種鑒定、指紋圖譜構(gòu)建和分子標(biāo)記輔助育種。本專利技術(shù)的優(yōu)點在于，提供了 670對基于梅花全基因組序列開發(fā)的SSR引物組的序列，其中包括144對梅花的SSR引物核心組的序列，建立了梅花SSR分子標(biāo)記的技術(shù)體系，井利用該144對核心引物組首次構(gòu)建了梅花SSR遺傳圖譜，有助于開展梅花重要觀賞性狀的QTL定位，加快梅花分子標(biāo)記輔助育種的進程。附圖說明圖I顯示了采用本專利技術(shù)方法構(gòu)建得到的梅花遺傳圖譜LGl LG8連鎖群。具體實施例方式以下實施例用于說明本專利技術(shù)，但不用來限制本專利技術(shù)的范圍。若未特別指明，實施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段，所用原料均為市售商品。實施例I梅花遺傳作圖群體的構(gòu)建根據(jù)作圖親本選配原則，以結(jié)實率高,柱頭發(fā)育良好的梅花品種‘粉瓣’為母本，散 粉量大，花粉生活力高的梅花品種‘扣子玉蝶’為父本。在父本初花期與盛花期吋，選取無病蟲害及生理缺陷的枝條上大蕾與中蕾期的花蕾，將花藥剝離平鋪在硫酸紙上，室溫(25°C)濕度(35%以下)，自然散粉20小吋，4°C保存?zhèn)溆谩Ｔ谀副境趸ㄆ冢x擇生長健壯的中短花枝，適當(dāng)修剪，用醫(yī)用鑷子小心地將雄蕊去除，去雄完成后，在9-17吋，柱頭上具有粘液時，用毛筆蘸取花粉涂于柱頭，完成授粉，計數(shù)并掛牌，馬上套袋隔離，共雜交2120朵花。果實發(fā)育115天時，人工采收，共采收561粒雜交種子，將收獲的果實去除果肉后，將種子取出，洗浄，晾干，置于4°C冷庫中砂藏催芽；將露白342粒種子播種于花盆中，待其生長到20-30cm時將310棵雜種苗移栽到大田中，注意水肥養(yǎng)護及病蟲害防護。實施例2基于梅花全基因組序列開發(fā)的SSR核心引物組的獲得I.本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護點】

【技術(shù)特征摘要】
1.梅花SSR遺傳圖譜的構(gòu)建方法，其特征在于，包括以下步驟 1)提取待測梅花親本與子代的基因組DNA; 2)利用生物學(xué)軟件，在梅花全基因組序列中，挖掘1-6個核苷酸重復(fù)單元的SSR標(biāo)記，并分別針對這些SSR標(biāo)記設(shè)計SSR引物； 3)分別利用上述SSR引物，各自以待測梅花親本和子代的基因組DNA為模版，進行PCR擴增； 4)利用生物學(xué)軟件分析PCR擴增結(jié)果，構(gòu)建出梅花SSR遺傳圖譜。2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述待測梅花親本是以梅花品種‘粉瓣’為母本，以‘扣子玉蝶’為父本。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，步驟2)中挖掘1-6個核苷酸重復(fù)單元的SSR標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)為單核苷酸重復(fù)單元最小的重復(fù)長度為10bp，二核苷酸到四核苷酸重復(fù)單元最小的重復(fù)長度為12bp，五核苷酸重復(fù)...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：張啟翔，孫麗丹，程堂仁，楊煒茹，王佳，祿久幸，李旭東，
申請(專利權(quán))人：北京林業(yè)大學(xué)，
類型：發(fā)明
國別省市：