用于檢測萊姆病螺旋體的環介導等溫擴增法制造技術

本發明專利技術提供一種用于檢測萊姆病螺旋體的環介導等溫擴增法，其是采用引物FIP和BIP以及F3和B3(如Seq?ID?No.1-4所示)對待測樣品DNA進行恒溫擴增反應。本發明專利技術將LAMP引物恒溫擴增技術用于萊姆病螺旋體的快速檢測，可從疑似病人血清中準確地檢測出萊姆病螺旋體。該方法的特異性和靈敏度均較常規PCR更高，可對不同致病基因型的萊姆病螺旋體進行檢測，對萊姆病的早期診斷、早期治療等方面具有重要意義；同時可以免除高昂的儀器投入，便于基層推廣使用。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及萊姆病螺旋體的檢測，具體地說，涉及用于檢測萊姆病螺旋體的環介導等溫擴增法。
技術介紹
萊姆病(Lyme disease)是由伯氏疏螺旋體(Bolrelia burgdorferi)弓丨起的一種慢性自然疫源性疾病。伯氏疏螺旋體是ー種單細胞的革蘭氏陰性螺旋體。該病主要是通過節肢動物蜱的叮咬在宿主動物與宿主動物及人之間傳播。萊姆病臨床表現初期多有典型皮膚損害--慢性游走性紅斑(ECM)，同時伴有頭痛、發熱、寒戰、疲乏不適.局部淋巴結腫大等癥狀，后期表現為神經系統、循環系統、運動系統等呈間歇性、交替性出現的各種損害。具有分布廣、病程長、病死率較高等特點。如能早期診斷、早期治療常可痊愈，否則會出現嚴重并發癥。因此開發萊姆病螺旋體的早期快速檢測技木，對萊姆病早期診斷、早期治療具有重要的意義。目前萊姆病的主要診斷方法包括病原學檢測和特異性抗體檢測。病原學檢測包括直接鏡檢法、病原分離培養、多聚酶鏈反應(PCR)和熒光定量PCR(real-time PCR);常用的特異性抗體檢測包括間接免疫熒光抗體法(IFA)、酶聯免疫吸附實驗(ELISA)和蛋白免疫印跡法(WB)。直接鏡檢法需要操作者具備豐富的檢驗經驗，然而對于混合感染的情況，則無法檢測到，而且該法容易漏檢，與其他診斷方法相比，直接檢查的檢出率相對較低。病原分離培養法的分離率低，耗時較長，敏感性差。IFA只能檢測到菌體表面的抗原，靈敏度和特異性都比較低，且IFA受實驗因素影響大，易造成假陽性或假陰性。ELISA主要對萊姆病特異抗體IgG進行檢測，傳統ELISA檢測方法，存在非特異反應，雖然靈敏度高，但缺乏特異性，易誤診。WB可以判斷和驗證IFA和ELISA的真假陽性，但由于萊姆病螺旋體有不同的致病基因型，而這幾種基因型在世界各地的分布又有所不同，因此各國應根據實際情況，制定出針對本國流行的基因型的WB陽性診斷標準，而且WB的操作比較復雜，不利于推廣。PCR技術的不足之處在于(I)靶基因易被污染；(2)易出現非特異性擴増；(3)擴增反應易受多種因素的影響；(4)需要投入比較昂貴的精密儀器(如PCR儀、凝膠電泳儀及凝膠成像系統)；耗時長，需要2 3h的反應時間和I 2h的電泳時間。這些均不利于現場的快速檢測，給技術的基層推廣造成了極大障礙。2000年Notomi等開發了一種新的核酸等溫擴增方法，即環介導等溫擴增法(loop-mediated isothermal amplification, LAMP),其特點是在等溫條件下即可高效、快速、高特異、高靈敏地擴增靶基因序列。目前LAMP技術主要應用于病原微生物的快速檢測，包括病毒、細菌、真菌、支原體、寄生蟲等，在臨床疾病診斷、食品衛生檢驗及環境監測方面應用廣泛，另外，LAMP也應用于動物胚胎的性別鑒定、腫瘤的基因檢測及原位擴增等。然而未見利用LAMP技術進行萊姆病螺旋體檢測的相關報道。
技術實現思路
本專利技術的目的是提供一種便于基層推廣使用的檢測萊姆病螺旋體的環介導等溫擴增法。本專利技術的另一目的是提供用于檢測萊姆病螺旋體的LAMP引物及含有該引物的試劑盒。為了實現本專利技術目的，本專利技術的ー種用于檢測萊姆病螺旋體的LAMP引物組，其包括外側正向引物F3 :5 ’ -GCTGTTGAGCTCCTTCTTG-3 ’ ；外側反向引物B3 :5’ -CACCAGCGTCACTTTCAG-3’ ；以及 內側正向引物 FIP : 5 ’ -TGCAAATCTATTCTCTGGCGAAGGTTGAGCACCTTCTTGAACA-3 ’ ；內側反向引物BIP :5’ -ACAGCAATCGCTTCATCTTGATTCTCAAGCTTCTTGGACC-3’。本專利技術還提供含有上述LAMP引物組的用于檢測萊姆病螺旋體的試劑盒，其中所述試劑盒包括引物FIP、BIP、F3和B3。前述試劑盒中還包括Bst DNA聚合酶和/或反應緩沖液。更優選地，前述試劑盒還包括標準陽性模板。本專利技術進一歩提供用于檢測萊姆病螺旋體的環介導等溫擴增法，包括步驟1)提取樣品中的DNA ;2)以步驟I)中提取的DNA為模板，使用上述LAMP引物組，進行LAMP擴增反應；3)分析產物，即對上述擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳，根據電泳檢測結果判定樣品中是否含有萊姆病螺旋體。其中，LAMP反應體系以25 μ I計為 模板DNA2μ1 20μΜ 引物FlP2μ20μΜ 引物BIP2μ! ΙΟμΜ引物F30.5μ1 ΙΟμΜ引物Β30·5μ18υ/μ1 Bst DNA 聚合酶Ιμ 2 X Reaction Mix12.5μ!ddH.O補足至 25μ1。LAMP反應條件為59-66 °C (優選63 °C ) 60分鐘，冰上終止反應。用上述引物組對待測樣品DNA進行恒溫擴增，若電泳檢測結果出現梯狀DNA條帶，則該樣品含有萊姆病螺旋體，若沒有擴增出條帶，則該樣品中不含萊姆病螺旋體。本專利技術將LAMP引物恒溫擴增技術用于萊姆病螺旋體的快速檢測，可從疑似病人血清中準確地檢測出萊姆病螺旋體。該方法的特異性和靈敏度均較常規PCR更高，可對不同致病基因型的萊姆病螺旋體進行檢測，對萊姆病的早期診斷、早期治療等方面具有重要意義；同時可以免除高昂的儀器投入，便于基層推廣使用。附圖說明圖IA和圖IB為本專利技術LAMP引物組恒溫擴增結果；其中，圖IA中泳道1_5分別為萊姆病螺旋體B31、PD91、Fuji、FPU QX-S13，NC為陰性對照，圖IB泳道I為TO91，泳道2-12為8種立克次體屬的菌株和鉤端螺旋體、 布魯氏菌、大腸埃希菌共11種對照菌株。圖2為LAMP引物組恒溫擴增反應體系靈敏度檢測結果，其中，A1-A7分別代表重組質粒濃度為 I. OX IO6Copies/ μ 1、1· OX IO5Copies/ μ 1、1· OX IO4Copies/ μ I、1.0Χ IO3Copies/ μ 1、1· OX IO2Copies/ μ 1、1· OX IO1Copies/ μ 1、1· OX IO0Copies/ μ I。圖3為普通PCR擴增反應體系靈敏度檢測結果，其中，M為IOObp Ladder, 1-7分別代表重組質粒濃度為 I. OX IO6Copies/ μ 1、1· OX IO5Copies/ μ 1、1· OX IO4Copies/ μ I、I.O X IO3Copies/ μ I、I. O X IO2Copies/ μ I、I. OX IO1Copies/ μ I、I. OX IO0Copies/ μ I, 8為陰性對照。具體實施例方式以下實施例用于說明本專利技術，但不用來限制本專利技術的范圍。以下實施例均按照常規實驗條件，如SambiOOk等分子克隆實驗手冊(New York Gold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的操作技術規程,或按照制造廠商所建議的實驗條件。實施例I用于檢測萊姆病螺旋體的LAMP弓I物組的合成使用B31、PD91、Fujji, FPU QX-S13共5種萊姆病螺旋體菌株進行用于檢測萊姆病螺旋體的LAMP引物的篩選。B31、Fuji購自美國ATCC，PD91、FP1、QX-S13由中國疾控中心傳染病所分本文檔來自技高網...

【技術保護點】

【技術特征摘要】
1.用于檢測萊姆病螺旋體的LAMP引物組，其特征在于，其包括 外側正向引物 F3 :5’ -GCTGTTGAGCTCCTTCTTG-3’ ； 外側反向引物 B3 :5’ -CACCAGCGTCACTTTCAG-3’ ；以及 內側正向引物 FIP :5’ -TGCAAATCTAITCTCTGGCGAAGGITGAGCACCTTCTTGAACA-3’ ； 內側反向引物 BIP :5’ -ACAGCAATCGCTTCATCTTGAITCTCAAGCTTCTTGGACC-3’。2.含有權利要求I所述LAMP引物組的用于檢測萊姆病螺旋體的試劑盒。3.根據權利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括BstDNA聚合酶和/或反應緩沖液。4.根據權利要求2或3所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括標準陽性模板。5.用于檢測...

【專利技術屬性】
技術研發人員：郝琴，張劉麗，侯學霞，耿震，
申請(專利權)人：中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所，
類型：發明
國別省市：