用于雌激素受體α基因內(nèi)含子1 P vuII 和X baI 多態(tài)性焦磷酸檢測的引物制造技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)公開了用于雌激素受體α基因內(nèi)含子1PvuII和XbaI多態(tài)性焦磷酸檢測的引物，所述引物包括從樣本核酸中擴(kuò)增雌激素受體α基因PvuII和XbaI核酸片段的特異性引物和對獲得的核酸片段進(jìn)行焦磷酸測序的引物。采用焦磷酸測序法技術(shù)，通過本發(fā)明專利技術(shù)的特異性的擴(kuò)增引物和焦磷酸測序引物，可檢測出與激素依賴性疾病相關(guān)的雌激素受體α基因內(nèi)含子1PvuII和XbaI多態(tài)性，特異性好，準(zhǔn)確度高。可以用于臨床作為原因不明月經(jīng)過少及其他一些激素依賴性相關(guān)疾病的早期預(yù)防、早期診斷的輔助性指標(biāo)及篩選。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)屬生命科學(xué)和生物
，特別涉及一種用于雌激素受體α基因內(nèi)含子I P VUlI和X bal多態(tài)性焦磷酸檢測的引物序列，采用焦磷酸測序法技術(shù)，能對人類雌激素受體α基因多態(tài)性進(jìn)行檢測，特異性好，準(zhǔn)確度高。
技術(shù)介紹
年輕女性月經(jīng)過少，是婦科常見癥狀。其危害是影響孕卵在子宮內(nèi)膜種植，導(dǎo)致反復(fù)流產(chǎn)、不孕等，是閉經(jīng)的前驅(qū)癥狀。雌激素是調(diào)節(jié)月經(jīng)的主要激素，但臨床上發(fā)現(xiàn)ー類病人其雌激素水平正常，無內(nèi)外科及先天性疾病，我們稱為原因不明月經(jīng)過少。同時，我們對大量原因不明月經(jīng)過少患者進(jìn)行宮腔鏡檢查發(fā)現(xiàn)，月經(jīng)過少患者中有許多病員的子宮內(nèi)膜光滑菲薄，表現(xiàn)為生長發(fā)育不良。與傳統(tǒng)的子宮內(nèi)膜損傷、疤痕學(xué)說并不吻合。此類患者雌激素水平正常。N ilsson等認(rèn)為ER基因單核苷酸多態(tài)性(single nucleo t idepo Iymo rph ism, SN P)可能導(dǎo)致基因在轉(zhuǎn)錄、翻譯水平失調(diào)，導(dǎo)致ERa表達(dá)、功能異常。在ERa基因上游有多種多態(tài)性位點(diǎn)存在，其中2個限制性酶切片段長度多態(tài)性的確切酶切位點(diǎn)已被確定，在內(nèi)含子I存在P vull或X bal多態(tài)性。所以從ERa基因多態(tài)性探討原因不明月經(jīng)過少的發(fā)病機(jī)制，為進(jìn)一歩深入研究和治療提供理論依據(jù)。在臨床實(shí)驗(yàn)室中，目前檢測雌激素受體a基因P vull和X bal多態(tài)性的常用方法為限制性片段長度多態(tài)性(restriction fragment length polymorphism,RELP)法。該技術(shù)為第一代DNA分子標(biāo)記技木，利用限制性內(nèi)切酶能識別DNA分子的特異序列，并在特定序列處切開DNA分子，即產(chǎn)生限制性片段的特性，該方法的缺陷在于檢測靈敏度低且只能檢測大概型別，不能具體到突變比例。本專利技術(shù)在原有的基礎(chǔ)上進(jìn)行焦磷酸測序檢測，不僅能檢測到多態(tài)性位點(diǎn)的具體突變情況，也能根據(jù)圖譜辨別出突變比例，使檢測結(jié)果更加具體化。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供用于雌激素受體α基因內(nèi)含子I Pvull和X bal多態(tài)性焦磷酸檢測的引物。用于雌激素受體α基因內(nèi)含子I P vull和X bal多態(tài)性焦磷酸檢測的引物，所述引物包括從樣本核酸中擴(kuò)增雌激素受體α基因P vull和X bal核酸片段的特異性引物和對獲得的核酸片段進(jìn)行焦磷酸測序的引物，其特征在干，從樣本核酸中擴(kuò)增雌激素受體α基因P vull和X bal核酸片段的特異性引物序列為Xba IF:: 5’- GATTCCAGGCATGAACCACC-3’ (SEQ ID No. I) Xba IR:: 5’-GCCGTCTGTTGCAGCAAAA-3’ (SEQ ID No. 2)PVuII F: 5’-GATTCCAGGCATGAACCACC-3’ (SEQ ID No. 3)PVuII R: 5’- GCCGTCTGTTGCAGCAAAA-3’ (SEQ ID No. 4) 其中Xba IF和PVuII R為5’端生物素標(biāo)記引物； 對獲得的核酸片段進(jìn)行焦磷酸測序的引物序列為Xba IS: 5，-CAATGCTCATCCCAAC-3， (SEQ ID No. 5)PVuII S: 5’-TTCCAAATGTCCCAG-3’ (SEQ ID No. 6) 本專利技術(shù)將測序技術(shù)應(yīng)用于雌激素受體α基因多態(tài)性位點(diǎn)的檢測，設(shè)計出將Era基因多態(tài)性位點(diǎn)包含在內(nèi)的擴(kuò)增引物和焦磷酸測序引物，進(jìn)行P C R擴(kuò)增(擴(kuò)增片段長度為47Ibp)并進(jìn)行焦磷酸測序分析。采用焦磷酸測序法技術(shù)，通過本專利技術(shù)的特異性的擴(kuò)增引物和焦磷酸測序引物，可檢測出與激素依賴性疾病相關(guān)的雌激素受體a基因內(nèi)含子I P vull和X bal多態(tài)性，特 異性好，準(zhǔn)確度高。可以用于臨床作為原因不明月經(jīng)過少及其他ー些激素依賴性相關(guān)疾病的早期預(yù)防、早期診斷的輔助性指標(biāo)及篩選。附圖說明圖I是XbaI野生型。圖2是XbaI雜合型。圖3是XbaI突變型。圖4是PvuII野生型。圖5是PvuII雜合型。圖6是PvuII突變型。具體實(shí)施例方式本專利技術(shù)用于雌激素受體α基因內(nèi)含子I P vull和X bal多態(tài)性焦磷酸檢測的引物，包括從樣本核酸中擴(kuò)增雌激素受體α基因P vull和X bal核酸片段的特異性引物和對獲得的核酸片段進(jìn)行焦磷酸測序的引物，其中， 從樣本核酸中擴(kuò)增雌激素受體α基因P vull和X bal核酸片段的特異性引物序列為Xba IF:: 5’- GATTCCAGGCATGAACCACC-3’ (SEQ ID No. I)Xba IR:: 5’-GCCGTCTGTTGCAGCAAAA-3’ (SEQ ID No. 2)PVuII F: 5’-GATTCCAGGCATGAACCACC-3’ (SEQ ID No. 3)PVuII R: 5’- GCCGTCTGTTGCAGCAAAA-3’ (SEQ ID No. 4) 其中Xba IF和PVuII R為5’端生物素標(biāo)記引物； 對獲得的核酸片段進(jìn)行焦磷酸測序的引物序列為Xba IS: 5，-CAATGCTCATCCCAAC-3， (SEQ ID No. 5)PVuII S: 5’-TTCCAAATGTCCCAG-3’ (SEQ ID No. 6) 采用焦磷酸測序法技術(shù)，通過本專利技術(shù)的特異性的擴(kuò)增引物和焦磷酸測序引物，可檢測出與激素依賴性疾病相關(guān)的雌激素受體α基因內(nèi)含子I P vull和X bal多態(tài)性，具體步驟如下 I.I核酸提取 試劑紅細(xì)胞裂解液，核酸提取液。操作步驟取500ul全血，放入到I. 5ml的離心管中，加入Iml紅細(xì)胞裂解液。上下翻轉(zhuǎn)，使完全混勻，旋轉(zhuǎn)搖動15秒后放入 離心機(jī)中離心,離心速率為5000rpm, I Omin.。倒掉上層液，可見離心管底部有血色沉淀。加入500ul紅細(xì)胞裂解液，重復(fù)此裂解步驟一次。離心5000rpm，5min，最后用移液管吸凈所有上層液棄去，以使離心管底部的血色沉淀不再殘留有裂解液，在沉淀里加入60ul核酸提取液(取之前反復(fù)吹打)，用槍頭混勻，金屬浴100度10分鐘，12000 rpm, 5min,取上清-20度保存待用。I. 2 PCR 擴(kuò)增 PCR擴(kuò)增體系5* Buffer 12 μ I, dNTP 3μ I, Taq酶3 μ 1，上游引物3 μ 1，下游引物3 μ I,純水24 μ I,加2μ I逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物到48 μ I擴(kuò)增體系中，總體積為50 μ I。反應(yīng)條件為95度5分鐘，98度10秒；56度20秒；68度30秒，40個循環(huán)，68度2分鐘。I. 3 電泳 取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物3μ I進(jìn)行瓊脂糖電泳，檢測是否擴(kuò)增成功，目的條帶清晰較亮的進(jìn)行后續(xù)焦磷酸測序反應(yīng)。I. 4焦磷酸測序 試劑75% Ziff, Denaturation Solution, Binging Buffer, Annealing Buffer,I X Wash Buffer, Streptavidin Sepharase High Performance (bead), PyroMark GoldQ96 Reagents (E\S\dNTP)，DMSO。 步驟按照PyroMark Q96 (美國QIAGEN公司)操作說明書進(jìn)行操作。I. 5實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析。檢測過程中，四種dNTP (dA本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】

【技術(shù)特征摘要】
1.用于雌激素受體α基因內(nèi)含子I P VUlI和X bal多態(tài)性焦磷酸檢測的引物，所述引物包括從樣本核酸中擴(kuò)增雌激素受體α基因P VUlI和X bal核酸片段的特異性引物和對獲得的核酸片段進(jìn)行焦磷酸測序的引物，其特征在干， 從樣本核酸中擴(kuò)增雌激素受體α基因P VUlI和X bal核酸片段的特異性引物序列為Xba IF:: 5’- GATTCCAGGCATGAACCACC-3’ (SEQ ID No. I)Xba IR:: 5’-GCCGTCTGTTGCAGCAAAA-3’ (SEQ ID N...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：方國偉，葛嬋，王淑一，
申請(專利權(quán))人：北京艾迪康醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：