本發(fā)明專利技術(shù)涉及一種基因序列，具體涉及一種產(chǎn)色葡萄球菌gap基因序列及其引物的獲取方法，它采取平板劃線和稀釋涂布相結(jié)合的方法對(duì)淡水魚腸道細(xì)菌在甘露醇高鹽瓊脂（MSA）培養(yǎng)基上進(jìn)行分離篩選，獲得1株菌株，通過(guò)專用培養(yǎng)基培養(yǎng)后進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察、生理生化特征和基因序列分子鑒定等系統(tǒng)研究，確定該菌株為產(chǎn)色葡萄球菌；通過(guò)培養(yǎng)提取該株菌的基因組DNA后，根據(jù)該保守序列進(jìn)行BLAST核苷酸序列比對(duì)，參照葡萄球菌屬保守序列設(shè)計(jì)的用于擴(kuò)增gap基因片段的特異性，利用PCR技術(shù)擴(kuò)增產(chǎn)色葡萄球菌的基因組gap序列，篩選的這對(duì)引物獲得了用于檢測(cè)該菌PCR擴(kuò)增片段大小為931bp的引物，引物序列為正向gap-F（5’-3’）:ATGGTTTTGGTAGAATTGGTCGTTTA，反向gap-R（5’-3’）:GACATTTCGTTATCATACCAAGCTG。
【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及一種基因序列，具體涉及，屬生物檢測(cè)
技術(shù)介紹
葡萄球菌廣泛分布于自然界及人體與動(dòng)物皮膚黏膜表面，是最常見(jiàn)的化膿性球菌，常引起各種化膿性感染、敗血癥和泌尿道感染等，是醫(yī)院感染和社區(qū)獲得性感染的重要病原菌之一。葡萄球菌屬至少包含39個(gè)已知種，其中11種又可以分為兩個(gè)或更多的亞種，目前發(fā)現(xiàn)的種類已超過(guò)了 50種。葡萄球菌屬的細(xì)菌是一類球形菌，革蘭氏染色反應(yīng)呈陽(yáng)性。關(guān)于葡萄球菌引起魚類疾病未見(jiàn)報(bào)道，許多報(bào)道發(fā)現(xiàn)葡萄球菌屬的細(xì)菌為一些魚類 腸道細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)菌群。趙慶新發(fā)現(xiàn)團(tuán)頭魴腸道菌群中有葡萄球菌屬細(xì)菌的存在，有研究發(fā)現(xiàn)草魚腸道中的優(yōu)勢(shì)菌群為葡萄球菌屬細(xì)菌；孫云章等報(bào)道稚魚消化道的優(yōu)勢(shì)菌有葡萄球菌等。魚腸道正常菌群是腸道的重要組成部分，對(duì)魚本身沒(méi)有致病性，但對(duì)其他生物有可能有致病性。由于葡萄球菌有極高的相似性(90% 99%)，用16S rDNA不能將其在種的水平上準(zhǔn)確鑒定，以往人們使用hsp60, sodA, rpoB, tuf等保守基因?qū)ζ咸亚蚓M(jìn)行種間判定。葡萄球菌gap基因編碼甘油醒-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase),是一種管家基因,研究表明，該基因至少可以在12株葡萄球菌亞種檢測(cè)至IJ。Yugueros等人采用雜交的方法，用279bpDNA片段檢測(cè)在所有PCR-gap陽(yáng)性基因，結(jié)果均呈陽(yáng)性；應(yīng)用該引物擴(kuò)增其他菌種，結(jié)果都沒(méi)有出現(xiàn)目的條帶。產(chǎn)色葡萄球菌是一類不運(yùn)動(dòng)，不產(chǎn)生孢子的革蘭氏陽(yáng)性菌，在環(huán)境中廣泛存在，并且表現(xiàn)出很強(qiáng)的適應(yīng)性與異質(zhì)性，是人與動(dòng)物的機(jī)會(huì)致病菌，與豬的滲出性皮炎、膿毒性多關(guān)節(jié)炎及奶牛的乳腺炎有關(guān)。迄今為止，針對(duì)淡水魚類及其水產(chǎn)品中產(chǎn)色葡萄球菌的快速檢測(cè)方法，國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道和專利技術(shù)專利
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的是為了能快速檢測(cè)淡水魚類腸道及其水產(chǎn)品中的產(chǎn)色葡萄球菌，提供，從已知序列基因的保守序列引物來(lái)對(duì)gap基因進(jìn)行PCR檢測(cè)的方法。主要內(nèi)容為采取平板劃線和稀釋涂布相結(jié)合的方法對(duì)淡水魚腸道細(xì)菌在甘露醇高鹽瓊脂(MSA)培養(yǎng)基上進(jìn)行分離篩選，獲得I株菌株，通過(guò)專用培養(yǎng)基培養(yǎng)后進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察、生理生化特征和基因序列分子鑒定等系統(tǒng)研究，確定該菌株為產(chǎn)色葡萄球菌；通過(guò)培養(yǎng)提取該株菌的基因組DNA后，根據(jù)該保守序列進(jìn)行BLAST核苷酸序列比對(duì)，參照葡萄球菌屬保守序列設(shè)計(jì)的用于擴(kuò)增gap基因片段的特異性，利用引物設(shè)計(jì)軟件primer5. 0設(shè)計(jì)引物；將設(shè)計(jì)好的引物送交公司合成，利用PCR技術(shù)擴(kuò)增產(chǎn)色葡萄球菌的基因組gap序列，篩選的這對(duì)引物獲得了用于檢測(cè)該菌PCR擴(kuò)增片段大小為931bp的引物，引物序列為正向 gap-F (5 ’ -3 ’) ATGGTTTTGGTAGAATTGGTCGTTTA，反向 gap-R(5’ -3’) GACATTTCGTTATCATACCAAGCTG。本專利技術(shù)是以如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的一種產(chǎn)色葡萄球菌gap基因序列的獲取方法，其特征是采取平板劃線和稀釋涂布相結(jié)合的方法對(duì)淡水魚腸道細(xì)菌在甘露醇高鹽瓊脂(MSA)培養(yǎng)基上進(jìn)行分離篩選，獲得I株菌株，通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察、生理生化特征和基因序列分子鑒定等系統(tǒng)研究，確定該菌株為產(chǎn)色葡萄球菌。一種產(chǎn)色葡萄球菌gap基因序列的PCR特異引物設(shè)計(jì)方法，其特征是通過(guò)BLAST核苷酸序列比對(duì)，找到該物種需要檢測(cè)的目的基因的保守序列；根據(jù)該保守序列，設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增gap基因片段的特異性引物，用引物設(shè)計(jì)軟件primerf.O設(shè)計(jì)引物；將引物再通過(guò)核苷酸序列比對(duì)，確保引物3’端的高度保守性；具體步驟如下 (1)產(chǎn)色葡萄球菌的引物篩選將設(shè)計(jì)好的引物送交生工生物工程(上海)有限公司合成，對(duì)獲得的引物利用PCR技術(shù)擴(kuò)增產(chǎn)色葡萄球菌的基因組DNA，檢測(cè)各對(duì)引物是否可用，即能否擴(kuò)增出清晰、單一、有規(guī)則的條帶，在篩選的這些引物中，獲得了用于檢測(cè)該菌PCR擴(kuò)增片段大小為931bp的引物，gap基因編碼氨基酸序列310aa，引物序列為正向 gap-F (5，-3，) ATGGTTTTGGTAGAATTGGTCGTTTA，反向 gap-R (5，-3，):GACATTTCGTTATCATACCAAGCTG ； (2)產(chǎn)色葡萄球菌的PCR擴(kuò)增條件優(yōu)化對(duì)獲得的該屬分離菌株的gap基因?qū)Ｓ靡镞M(jìn)行PCR條件優(yōu)化，獲得最佳的PCR擴(kuò)增體系和擴(kuò)增條件如下最佳的PCR擴(kuò)增體系為25 yl，包含 2. 5 ii I IOX Reaction Buffer (with Mg2+) ,0. 5u I dNTP (包括 dATP、dITP、dCTP、dGTP，各2. 5mM)，正反向引物(10剛)各0. 5iU，Taq酶0. 3 yl，提取的細(xì)菌基因組DNA模板2.OiU，用滅菌雙蒸水ddH20 17. 2 u I補(bǔ)足25iU總體積；最佳的PCR反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性5min ；94°C變性30s，52°C退火50s，72°C延伸45s，30個(gè)循環(huán)后72°C再次延伸IOmin,PCR產(chǎn)物4°C保存?zhèn)溆茫? (3)產(chǎn)色葡萄球菌的分子測(cè)序鑒定采用10g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，切下目的帶，膠回收試劑盒回收，回收產(chǎn)物克隆后，挑選陽(yáng)性克隆送上海生工測(cè)序；測(cè)序后利用BLAST和ClustalX程序進(jìn)行序列比對(duì)分析,并用Neighbor-joining方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹表明該菌株與產(chǎn)色葡萄球菌(Ste/成cAroffiogefles)模式菌株(CCM 3387)同源性為98. 82%，由此鑒定該菌為產(chǎn)色葡萄球菌。本專利技術(shù)通過(guò)PCR擴(kuò)增技術(shù)篩選出葡萄球菌屬的專用引物，建立一個(gè)適合于檢測(cè)淡水魚源產(chǎn)色葡萄球菌分子檢測(cè)技術(shù)，更具有如下優(yōu)點(diǎn) I、成本底，實(shí)驗(yàn)操作安全、可靠。該菌株是采取平板劃線和稀釋涂布相結(jié)合的方法從淡水魚腸道細(xì)菌分離篩選，并通過(guò)專用培養(yǎng)基培養(yǎng)后獲得，在一般的微生物實(shí)驗(yàn)室都可以進(jìn)行；對(duì)菌株進(jìn)行分子鑒定時(shí)，采用普通PCR方法，使用常規(guī)的試劑和儀器，不需要探針和構(gòu)建基因文庫(kù)，所以避免使用同位素污染。2、技術(shù)簡(jiǎn)單可行。本專利技術(shù)充分利用生物信息學(xué)提供的已有信息，通過(guò)BLAST核苷酸序列比對(duì)，找到該物種需要檢測(cè)的目的基因的保守序列；根據(jù)該保守序列，設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增gap基因片段的特異性引物，用引物設(shè)計(jì)軟件primerf.O設(shè)計(jì)引物；將引物再通過(guò)核苷酸序列比對(duì)，確保引物3’端的高度保守性。3、快速、準(zhǔn)確、可靠。與傳統(tǒng)檢測(cè)方法相比，避免了與基因組進(jìn)行大規(guī)模測(cè)序，節(jié)省了大量的時(shí)間和財(cái)力，只要找到基因的保守序列，就可以對(duì)任何物種的該基因進(jìn)行跨物種PCR檢測(cè)；同時(shí)本專利技術(shù)引物特異性強(qiáng)，使得擴(kuò)增特異性和效率大大增強(qiáng)。附圖說(shuō)明下面結(jié)合附圖及實(shí)施例對(duì)本專利技術(shù)作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。圖I為本專利技術(shù)gap基因PCR產(chǎn)物電泳圖片。圖I 中M 為 DL-2000 DNA marker, gap 片段長(zhǎng)度為 931bp。具體實(shí)施例方式本專利技術(shù)可以通過(guò)以下幾個(gè)操作步驟實(shí)現(xiàn) I、產(chǎn)色葡萄球菌的分離培養(yǎng) 將淡水魚體表用75%的酒精消毒，無(wú)菌操作取其腸道中部，置于盛有IOmL的無(wú)菌生理鹽水的離心管中，剪碎混勻，取適量均勻涂布于甘露醇高鹽瓊脂培養(yǎng)基上，保持培養(yǎng)基內(nèi)的溫度為恒溫37°C，培養(yǎng)18-24h ;挑選典型菌落轉(zhuǎn)種到新的甘露醇高鹽瓊脂培養(yǎng)本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
【技術(shù)特征摘要】
1.一種產(chǎn)色葡萄球菌gap基因序列的獲取方法，其特征是采取平板劃線和稀釋涂布相結(jié)合的方法對(duì)淡水魚腸道細(xì)菌在甘露醇高鹽瓊脂(MSA)培養(yǎng)基上進(jìn)行分離篩選，獲得I株菌株，通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察、生理生化特征和基因序列分子鑒定等系統(tǒng)研究，確定該菌株為產(chǎn)色葡萄球菌。2.—種產(chǎn)色葡萄球菌gap基因序列的PCR特異引物設(shè)計(jì)方法，其特征是通過(guò)BLAST核苷酸序列比對(duì)，找到該物種需要檢測(cè)的目的基因的保守序列；根據(jù)該保守序列，設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增gap基因片段的特異性引物，用引物設(shè)計(jì)軟件primerf. O設(shè)計(jì)引物；將引物再通過(guò)核苷酸序列比對(duì)，確保引物3’端的高度保守性；具體步驟如下 (1)產(chǎn)色葡萄球菌的引物篩選將設(shè)計(jì)好的引物送交生工生物工程(上海)有限公司合成，對(duì)獲得的引物利用PCR技術(shù)擴(kuò)增產(chǎn)色葡萄球菌的基因組DNA，檢測(cè)各對(duì)引物是否可用，即能否擴(kuò)增出清晰、單一、有規(guī)則的條帶，在篩選的這些引物中，獲得了用于檢測(cè)該菌PCR擴(kuò)增片段大小為931bp的引物，gap基因編碼氨基酸序列310aa，引物序列為正向 gap-F (5，-3，) ATGGTTTTGGTAGAATTGGTCGTTTA，反向 gap-R (5，-3，):GACATTTCGTTATCATACCAAGCTG ； (2)產(chǎn)色葡萄球菌的PC...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：呂愛(ài)軍，胡秀彩，王藝，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：江蘇師范大學(xué)，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：
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