通用型甲型流感病毒(IAV)的實時熒光核酸恒溫擴增檢測試劑盒制造技術

本發明專利技術公開了一種通用型甲型流感病毒(IAV)的實時熒光核酸恒溫擴增檢測試劑盒。包括：捕獲探針、IAV擴增引物T7引物和nT7引物、IAV檢測探針、M-MLV反轉錄酶和T7?RNA聚合酶等試劑。本發明專利技術試劑盒能夠檢測拭子中的IAV?RNA，具有特異性高、靈敏度高(可達100copies/反應)、污染低(擴增產物RNA在自然環境下易于降解)及快速檢測(常規50分鐘完成檢測)的特點，將在通用型甲型流感早期感染的臨床診斷中發揮重要作用，應用前景廣闊。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及病毒的生物檢測技術，具體涉及將特異性靶標捕獲技術和實時熒光核酸恒溫擴增檢測技術結合的通用型甲型流感病毒(IAV)的實時熒光核酸恒溫擴增檢測中使用的引物、探針及相關試劑盒。
技術介紹
流感病毒根據核蛋白(NP)和基質蛋白(M)不同分為甲、乙、丙三型。甲型流感病毒基因組由8條負鏈RNA節段構成，根據表面血凝素(HA)和神經氨酸酶(NA)的不同分為16個HA亞型和9個NA亞型。 甲型流感病毒為常見流感病毒，易變異，最具攻擊力，可引起人的流感并有時引起肺炎和其他并發癥，主要是氣管和支氣管纖毛柱狀上皮細胞的壞死和脫落，有些病毒株能自然感染禽類和哺乳類動物，具有暴發突然、蔓延迅速、流行廣泛的特點。世界范圍的流感大流行共發生4次，其中1918-1919年世界流感大流行導致2000萬人死亡。中國近半個世紀以來流感流行共計發生18次，其中3次為大流行。目前，常用的甲型流感病毒實驗室檢查方法包括1)免疫學檢測方法，如快速流感抗原檢測、免疫熒光法(或裝配的IFA)，此法靈敏度較低，不易推廣應用；2)細胞生物學檢測方法，常用有雞胚接種法和細胞培養法，此法對病毒分離法較敏感，但需要2-3周時間，無法實現早期快速診斷；3)分子生物學檢測方法，目前有逆轉錄酶-聚合酶鏈式反應(Reverse Transcriptase-PCR,簡稱RT-PCR)和實時突光定量聚合酶鏈式反應(Real TimeFluorescent Quantified PCR，簡稱FQ-PCR)，RT-PCR采用“基因擴增+擴增子檢測”的操作模式，易引起擴增物的污染，常造成實驗結果的假陽性或假陰性現象，實時熒光定量PCR(FQ-PCR)雖在技術上解決了上述問題，其靈敏度和準確度較高，但操作復雜，檢測成本相對昂貴，阻礙了其在發展中國家的大規模推廣使用。實時突光核酸恒溫擴增檢測技術(SimultaneousAmplification and Testing,簡稱SAT)是一種直接快速檢測RNA的方法，與檢測DNA的實時熒光PCR相比，不同之處，前者檢測體系多了一個逆轉錄反應的步驟，核酸擴增在一個溫度下進行(42°C )，無需熱循環。采用M-MLV逆轉錄酶和17 RNA多聚酶進行核酸擴增，相對于其它核酸擴增技術，反應抑制物更少，能有效減少假陰性結果。然而，SAT技術在不同種類病毒的檢測中應用所面臨的問題各不相同，需要具體分析病毒的特性進行專門設計。目前尚無針對甲型流感病毒(IAV)的實時熒光核酸恒溫擴增檢測技術的研究報道。
技術實現思路
為解決現有的通用型甲型流感病毒(IAV)檢測方法靈敏度較低，檢測周期長、易引起擴增物的污染造成實驗結果的假陽性或假陰性以及檢測成本較高的問題，本專利技術提供了一種檢測周期短、高靈敏度、高特異性、低污染、反應穩定以及檢測成本低、易于推廣應用的通用型甲型流感病毒(IAV)的實時熒光核酸恒溫擴增檢測技術，包括專用引物、探針、試劑盒及其使用。本專利技術所提供的通用型甲型流感病毒(IAV)的實時熒光核酸恒溫擴增檢測試劑盒，包含有一條捕獲探針，一對用于在M-MLV反轉錄酶作用下產生IAV靶標核酸(IAV RNA)的DNA拷貝的IAV擴增引物T7和nT7，和一條用于與在T7 RNA聚合酶作用下根據所述IAV靶標核酸(IAV RNA)的DNA拷貝產生的RNA拷貝特異結合的IAV檢測探針。所述捕獲探針可與如序列表中序列I所示的通用型甲型流感病毒(IAV)的靶標核酸(IAV RNA)序列特異結合，在有IAV內標(IAV IC RNA)時，其最好還可與該IAV內標序列特異結合，所述捕獲探針的核苷酸序列如序列表中序列2所示；所述IAV擴增引物由T7引物和nT7引物組成，T7引物序列如序列表中序列3所示，nT7引物序列如序列表中序列4所示；所述IAV檢測探針的核苷酸序列如序列表中序列5所示,5’端標記FAM突光基團,3’端標記DABCYL淬滅基團。進一步，所述試劑盒還包含有M-MLV反轉錄酶和T7 RNA聚合酶，所述M-MLV反轉 錄酶和17 RNA聚合酶存在于一 SAT酶液中，所述捕獲探針存在于一核酸提取液中，所述17引物、n!7引物和IAV檢測探針存在于一 IAV檢測液中。再進一步所述試劑盒還包含有IAV內標和內標檢測探針；所述IAV內標為競爭性內標，可與捕獲探針特異性結合，并與IAV靶標核苷酸(IAV RNA)使用同一對引物(T7和nT7)，IAV內標由序列表中序列7所示的IAV IC RNA ;所述內標檢測探針的核苷酸序列如序列表中序列6所示，5’端標記HEX熒光基團，3’端標記DABCYL淬滅基團，且所述內標檢測探針存在于IAV檢測液中。更進一步，所述試劑盒包含裂解液、核酸提取液、洗滌液、IAV反應液、IAV檢測液、SAT酶液、IAV陽性對照、IAV陰性對照和IAV內標，其中裂解液含硫酸銨((NH4) 2S04)和HEPES ；核酸提取液含捕獲探針和磁珠；洗滌液含NaCl和SDS ;IAV 反應液含 dNTP 和 NTP ；IAV檢測液含17引物、n!7引物、IAV檢測探針和內標檢測探針；SAT酶液含M-MLV反轉錄酶、T7 RNA聚合酶；IAV陽性對照；含甲型流感病毒(IAV)M基因的體外轉錄RNA稀釋物；IAV陰性對照不含有甲型流感病毒(IAV)靶標核酸(IAV RNA)序列或不含有甲型流感病毒的溶液，如生理鹽水；IAV內標含IAV內標RNA(IAV IC RNA,序列如序列表中序列7所示)。具體的，所述試劑盒中一個反應單位中上述各種試劑組成如下(I)裂解液HEPES 25-250mM, (NH4)2SO4 5_50mM ;(2)核酸提取液HEPES 50-400mM, EDTA 40-200mM, LiCl 400-2000mM，捕獲探針1-50 u M (優選為 5-25 u M)，磁珠 50-500mg/L (優選為 50-250mg/L)；(3)洗滌液HEPES 5_50mM，NaCl 50-500Mm, 1% SDS, EDTA I-IOmM ；(4) IAV 反應液Tris 10_50mM，MgCl2 10_40mM，dNTP 0. I-IOmM(優選為0. 5-5mM)，NTP l-20mM(優選為 I-IOmM)，PVP40 1-10%, KCl 5_40mM ；(5) IAV檢測液將IAV擴增引物和IAV檢測探針溶解在TE溶液(IOmM Tris和ImM EDTA的混合液)中配制而成，各引物和探針濃度在5-lOpmol/反應均可；其中17引物濃度優選為7. 5pmol/反應，nT7引物濃度優選為7. 5pmol/反應，IAV檢測探針濃度優選為5pmol/反應’內標檢測探針濃度優選為5pmol/反應；(6) SAT 酶液=M-MLV 反轉錄酶 400-4000U/ 反應(優選為 500-1500U/ 反應)、T7RNA 聚合酶 200-2000U/ 反應(優選為 500-1000U/ 反應)、2_10mM HEPES pH7. 5、IO-IOOmM N-acetyl_L-cysteine、0. 04-0. 4mM zinc acetate、IO-IOOmM trehalose、40-200mMTris-HCl pH 本文檔來自技高網...

【技術保護點】

【技術特征摘要】
1.一種通用型甲型流感病毒(IAV)的實時熒光核酸恒溫擴增檢測試劑盒，包含有一條序列表中序列I所示的通用型甲型流感病毒(IAV)的靶標核酸(IAV RNA)的捕獲探針，一對用于在M-MLV反轉錄酶作用下產生IAV靶標核酸(IAV RNA)的DNA拷貝的IAV擴增引物T7和nT7，和一條用于與在17 RNA聚合酶作用下根據所述IAV靶標核酸(IAV RNA)的DNA拷貝產生的RNA拷貝特異結合的IAV檢測探針。2.根據權利要求I所述試劑盒，其特征在于所述捕獲探針的核苷酸序列如序列表中序列2所示；所述IAV擴增引物由T7引物和n!7引物組成，T7引物序列如序列表中序列3所示，n!7引物序列如序列表中序列4所示；所述IAV檢測探針的核苷酸序列如序列表中序列5所示，5’端標記FAM熒光基團，3’端標記DABCYL淬滅基團。3.根據權利要求I或2所述的試劑盒，其特征在于所述試劑盒還包含有M-M LV反轉錄酶和17 RNA聚合酶，所述M-MLV反轉錄酶和17 RNA聚合酶存在于一 SAT酶液中，所述捕獲探針存在于一核酸提取液中，所述T7引物、nT7引物和IAV檢測探針存在于一 IAV檢測液中。4.根據權利要求3所述的試劑盒，其特征在于所述試劑盒還包含有IAV內標和內標檢測探針；所述IAV內標為IAV核苷酸序列(IAV RNA)的競爭性內標，可與捕獲探針特異性結合，并使用同一對引物(T7和nT7引物)，由序列表中序列7所示的IAV IC RNA ;所述內標檢測探針的核苷酸序列如序列表中序列6所示，5’端標記HEX熒光基團，3’端標記DABCYL淬滅基團，且所述內標檢測探針存在于IAV檢測液中。5.根據權利要求I至4任一所述的試劑盒，其特征在于所述試劑盒包含裂解液、核酸提取液、洗滌液、IAV反應液、IAV檢測液、SAT酶液、IAV陽性對照、IAV陰性對照和IAV內標，其中 裂解液含硫酸銨((NH4)2SO4)和HEPES ； 核酸提取液含捕獲探針和磁珠； 洗滌液含NaCl和SDS ； IAV反應液含dNTP和NTP ； IAV檢測液含17引物、n!7引物、IAV檢測探針和內標檢測探針； SAT酶液含M-MLV反轉錄酶、T7 RNA聚合酶； IAV陽性對照；含甲型流感病毒(IAV)M基因的體外轉錄RNA稀釋物； IAV陰性對照不含有甲型流感病毒(IAV)靶標核酸(IAV RNA)序列或不含有甲型流感病毒的溶液，如生理鹽水； IAV內標IAV內標RNA(IAV IC RNA,序列如序列表中序列7所示)。6.根據權利要求5所述的試劑盒，其特征在于所述試劑盒中一個反應單位中各種試劑組成如下(1)裂解液HEPES25-250mM, (NH4)2SO4 5_50mM ； (2)核酸提取液HEPES50-400mM, EDTA 40-200mM, LiCl 400-2000mM,捕獲探針1-50 u M (優選為 5-25 u M)，磁珠 50-500mg/L (優選為 50-250mg/L)；(3)洗滌液HEPES5-50mM, NaCl 50-500Mm, 1% SDS，EDTA I-IOmM ；(4)IAV 反應液Tris 10-50mM,MgCl2 10-40mM, dNTP 0. l-10mM(優選為 0. 5-5mM), NTPl-20mM(優選為 I-IOmM)，PVP40 1-10%, KCl 5-40mM ；(5)IAV檢測液將IAV擴增引物和IAV檢測探針溶解在TE溶液(IOmM Tris和ImM EDTA的混合液)中配制而成，各引物和探針濃度在5-lOpmol/反應均可；其中17引物濃度優選為7. 5pmol/反應，n!7引物濃度優選為7. 5pmol/反應，IAV檢測探針濃度優選為5pmol/反應，內標檢測探針濃度優選為5pmol/反應； (6)SAT酶液M-MLV反轉錄酶400-4000U/反應(優選為500-1500U/反應)、T7 RNA 聚合酶 200-2000U/ 反應(優選為 500-1000U/ 反應)、2_10mM HEPES pH7. 5、10-100mMN-acetyl-L_cysteine、0. 04-0. 4mM zinc acetate、IO-IOOmM trehalose、40-200mMTris-HCl pH 8. 0、40_200mM KC1、0. 01-0. 5m...

【專利技術屬性】
技術研發人員：方亮，于明輝，馮金夢，居金良，
申請(專利權)人：上海仁度生物科技有限公司，
類型：發明
國別省市：