用于親和色譜法的沖洗溶液和方法技術

本發明專利技術提供一種用于親和色譜法的沖洗方法，其中包含精氨酸或精氨酸衍生物和非緩沖鹽的優選在大于8.0的高pH的沖洗溶液可有效去除雜質如高分子量物和宿主細胞蛋白，同時還提高洗脫液中的產物濃度并且保持回收產物的高百分比產率。

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】
技術介紹
基于目標蛋白與固相如凝膠基質靶標的優先結合，親和色譜法可以從分子混合物如細胞采集物純化所述目標蛋白。該固相組分通常被制成柱子，供施加含有目標蛋白的混合物從中通過。在此初始步驟(稱為捕獲步驟)中，目標蛋白特異性地與固相靶標結合而混合物中的其它組分流過柱子。然而，混合物中的某些組分，包括高分子量物(HMW)、低分子量物(LMW)和宿主細胞蛋白(HCP)，可能作為雜質與目標蛋白一起保留在柱子內。因此，通常進行一個或多個沖洗步驟，該步驟中將一種或多種沖洗溶液施加 在柱子上以去除這些雜質同時保持目標蛋白與固相的結合。最后，在通過沖洗步驟去除雜質之后，通過洗脫步驟從柱子中回收目標蛋白，該步驟中將破壞目標蛋白與固相靶標的結合的洗脫溶液施加在柱子上并且在洗脫液中回收目標蛋白。因此，親和色譜法在純化目標蛋白中的有效性在很大程度上取決于確定可以高效去除雜質(例如HMW、LMW、HCP)同時不破壞目標蛋白與固相靶標的結合或另外不具有不希望的影響的沖洗條件。一種特別有用的親和色譜法類型是用于純化含有免疫球蛋白Fe段的蛋白質如抗體和Fe融合蛋白的蛋白A色譜法。已經描述有多種沖洗溶液用于從蛋白A柱去除雜質，包括含有以下之一的沖洗溶液疏水性電解質(例如PH為5. 0-7. O的氯化四甲銨、氯化四乙銨、氯化四丙銨或氯化四丁銨)、溶劑(例如5-20%異丙醇或聚丙烯/己二醇)、脲(例如濃度為1-4M)、洗滌劑(例如O. 1-1%吐溫20或吐溫80)、聚合物(例如5-15%聚乙二醇，如PEG400或PEG8000)或pH在5. O和7. O之間的濃度為O. 8-2. OM的高濃度緩沖溶液如Tris、HC1、醋酸鹽、硫酸鹽、磷酸鹽或檸檬酸鹽緩沖液(參見例如Shukla，A.A.和Hinckley, P.(2005) Biotechnol. Prog. 24:1115-1121 ；Blank 的美國專利第 6，127，526 號和第 6，333，398號；和Breece等的美國專利第6，870，034號)。然而，這些化學制劑許多都有一種或多種缺點，包括但不限于毒性、腐蝕性、可燃性、不穩定性、作為危險廢物的高處置成本和/或在沖洗步驟期間去除污染物的低效率。還描述了單獨含有鹽(如氯化鈉)或與洗滌劑(例如吐溫20)、溶劑(例如己二醇)或聚合物(例如聚乙二醇)組合的蛋白A色譜法沖洗緩沖液(Breece等的美國專利第6，870，034 號)。Barron等描述了用于蛋白A色譜法的中間沖洗溶液(intermediate washsolution)，其在pH為5· 0-7. 5的磷酸鹽/醋酸鹽緩沖液中含有O. 5至2. OM精氨酸(最佳為IM精氨酸，pH為5. O的O. IM磷酸鹽/醋酸鹽緩沖液)。該精氨酸沖洗步驟據報道用于去除HCP污染物。作者還測試了 pH為5. 0-7. 5含有O. 5-2. OM氯化鈉的中間沖洗溶液，但是報告NaCl沖洗未顯不HCP的顯著減少(Barron等，“ Improving Purity on Protein AAffinity Media Through Use of an Arginine Intermediate Wash Step”，http://www.priorartdatabase. com/IPCQM/000127319)。Sun等也描述了親和色譜柱(如蛋白A柱)的沖洗，使用含有精氨酸或精氨酸衍生物、濃度為O. 1-2. OM并且pH為4. 5-8. O的沖洗緩沖液(美國專利公布第20080064860號和第 20080064861 號；PCT 公布第 WO 2008/031020 號)。精氨酸還被用于從親和色譜柱和其它類型的純化柱洗脫蛋白質。例如，Arakawa等描述了使用含有O. 5-2. OM精氨酸、pH為4. 1-5. O的洗脫緩沖液從蛋白A柱洗脫抗體的方法(Arakawa 等，(2004) Protein Expression and Purification 36:244-248 Tsumoto,K.等，(2004)Biotechnol. Prog.迪1301-1308 ;美國專利公布第 20050176109 號)。此外，Ejima等的美國專利第7，501，495號描述了使用含有鹽酸精氨酸的展開液從凝膠過濾柱洗脫蛋白質的方法。Ghose等描述了使用精氨酸梯度作為洗脫劑從未衍生化二氧化硅洗脫目標蛋白的方法(Ghose, S.等，(2004)Biotech. Bioeng. 87:413-423)。Coffman 等的美國專利公布第20030050450號描述了從含Fe分子和蛋白A的復合物分離含Fe分子的方法，其中將Fe/蛋白A復合物施加在疏水作用柱(HIC)上并且用含有精氨酸的緩沖液沖洗柱子。專利技術概述本專利技術提供用于親和色譜法的高效而耐用的沖洗溶液以及使用該溶液的沖洗方法。該沖洗溶液在洗脫步驟之前的沖洗步驟中應用，其使用產生從親和基質洗脫的高產率和高濃度的目標蛋白，同時有效地從施加到基質的起始物料去除高分子量物(HMW)和宿主細胞蛋白(HCP)。沖洗溶液的特征在于同時存在精氨酸(或精氨酸衍生物)和非緩沖鹽，如 鹵鹽。沖洗溶液優選處于8. O以上的高pH。精氨酸(或精氨酸衍生物)和非緩沖鹽的所述組合比單獨含有精氨酸或鹽的沖洗溶液去除明顯更多的雜質并且產生與回收的目標蛋白的高濃度相關的陡峭的洗脫峰。因此，在一個方面，本專利技術提供使用供目標蛋白結合的親和色譜(AC)基質制備純化的目標蛋白的方法，所述方法包括在從AC基質洗脫目標蛋白之前用包含(i)精氨酸或精氨酸衍生物和(ii)非緩沖鹽的一種或多種沖洗溶液沖洗AC基質。優選地，在用一種或多種沖洗溶液沖洗之前將目標蛋白上樣到AC基質上，并且在用一種或多種沖洗溶液沖洗(具體來講)以從AC基質去除雜質之后從AC基質洗脫目標蛋白。在一個優選實施方案中，所述AC基質是蛋白A柱。在多種其它實施方案中，AC基質可以例如選自由以下組成的組蛋白G柱、蛋白A/G柱、蛋白L柱、固定化金屬尚子未和色譜(IMAC)柱、鈣調素樹脂柱、MEP HyperCel 柱、結合麥芽糖結合蛋白(MBP)的柱、結合谷胱甘肽-S-轉移酶(GST)的柱和結合Strep-Tag II的柱。雖然與本文中描述的親和基質結合的其它蛋白質也適用于根據本專利技術方法的純化，但是在一個優選實施方案中，所述目標蛋白是與AC基質如蛋白A柱結合的抗體或抗體片段。在一個優選實施方案中，所述一種或多種沖洗溶液包含鹽酸精氨酸，濃度優選在O.05-2. OM的范圍，更優選在O. 05-0. 85M的范圍，最優選在O. 1-0. 5M的范圍。在具體的實施方案中，鹽酸精氨酸存在的濃度為0. IM或約0. 1M、0. 25M或約0. 25M，或0. 5M或約0. 5M。在其它實施方案中，所述一種或多種沖洗溶液包含精氨酸衍生物，如選自由以下組成的組的衍生物乙酰基精氨酸、N-α - 丁酰基-精氨酸、胍丁胺(agmatine)、arginic acid和Ν-α-特戊酰基(pyvaloyl)精氨酸。雖然也涵蓋D-精氨酸，但是所述精氨酸或精氨酸衍生物優選包含L-精氨酸。在一個優選實施方案中，所述一種或多種沖洗溶液中的非緩沖鹽是氯本文檔來自技高網...

【技術保護點】

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】2009.12.18 US 61/288,0591.一種使用供目標蛋白結合的親和色譜(AC)基質制備純化的目標蛋白的方法，所述方法包括在從所述AC基質洗脫所述目標蛋白之前，用包含(i)精氨酸或精氨酸衍生物和( )非緩沖鹽的一種或多種沖洗溶液沖洗所述AC基質。2.根據權利要求I所述的方法，其中用包含(i)精氨酸或精氨酸衍生物和(ii)非緩沖鹽的一種沖洗溶液沖洗所述AC基質。3.根據權利要求2所述的方法，其中所述沖洗溶液包含鹽酸精氨酸。4.根據權利要求2所述的方法，其中所述非緩沖鹽是氯化鈉(NaCl)。5.根據權利要求I所述的方法，其中用第一沖洗溶液和第二沖洗溶液這兩種沖洗溶液沖洗所述AC基質，其中 (a)所述第一沖洗溶液包含精氨酸或精氨酸衍生物，所述第二沖洗溶液包含非緩沖鹽；或 (b)所述第一沖洗溶液包含非緩沖鹽，所述第二沖洗溶液包含精氨酸或精氨酸衍生物。6.根據權利要求1-5中任一項所述的方法，其中所述目標蛋白是與蛋白A柱結合的抗體或抗體片段。7.根據權利要求1-6中任一項所述的方法，其中所述一種或多種沖洗溶液從所述AC...

【專利技術屬性】
技術研發人員：A·弗勞恩舒，K·比爾，
申請(專利權)人：諾瓦提斯公司，
類型：發明
國別省市：