本發(fā)明專利技術涉及一種檢測豬繁殖與呼吸綜合癥病毒血清抗體的多重表位融合抗原，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO:1所示。本發(fā)明專利技術還涉及該多重表位融合抗原的制備方法，及檢測豬繁殖與呼吸綜合癥病毒抗體的試劑盒。本發(fā)明專利技術制備的多重表位融合抗原純度高，穩(wěn)定性好，而且制備工藝簡單，成產成本低，所述試劑盒的檢測靈敏度高，安全性強。
【技術實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術涉及一種檢測豬繁殖與呼吸綜合癥病毒血清抗體的多重表位融合抗原及其制備的試劑盒。
技術介紹
豬繁殖與呼吸綜合癥(Porcinereproductive and respiratory syndrome,PRRS)，俗稱豬藍耳病，是80年代末出現(xiàn)的一種新的豬傳染性疾病，其病原體是豬繁殖與呼吸綜合癥病毒(Porcine reproductive and respirator syndrome virus,PRRSV)。I987年美國首先報道了該病的發(fā)生，其癥狀主要表現(xiàn)為懷孕母豬發(fā)生流產、早產、死胎和木乃伊等嚴重的繁殖障礙，仔豬呼吸系統(tǒng)癥狀和斷奶前死亡率增高，育成 豬呼吸困難，發(fā)育遲緩，公豬性欲減退精液品質下降等。1991年歐洲爆發(fā)了毀滅性流行，造成了近百萬頭豬死亡。中國于1996年由中國農業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所首次從國內疑似豬繁殖與呼吸綜合癥病毒感染的豬場中分離到豬繁殖與呼吸綜合癥病毒，確認了本病在國內的發(fā)生和流行。2003年起許多專家都驚呼“全國豬場一片藍”，豬繁殖與呼吸綜合癥病毒的高感染率是一個不爭的事實。更為令人擔憂的是，2006年夏季，中國中南部爆發(fā)了高致病型豬繁殖與呼吸綜合癥，之后蔓延到全國各個省市。高致病型豬繁殖與呼吸綜合癥的特點是能使不同年齡和不同品種的豬都感染發(fā)病，且發(fā)病率高、病死率高、治愈率低。2007年，國內共有26個省份發(fā)生了高致病型豬繁殖與呼吸綜合癥，發(fā)病豬數(shù)量達30多萬頭，許多發(fā)病豬場的死淘率甚至達到100%。直至今日，疫病形勢依然嚴峻，高致病型豬繁殖與呼吸綜合癥病毒已經成為豬的三大致死性病原之首，嚴重地影響了國內畜牧業(yè)生產。由于目前還沒有有效的治療手段，所以對于豬繁殖與呼吸綜合癥，尤其是高致病型豬繁殖與呼吸綜合癥，及時、正確的診斷是預報疫情、控制流行態(tài)勢、防止疫病爆發(fā)的首要環(huán)節(jié)。豬繁殖與呼吸綜合癥病毒為有囊膜的單股正鏈RNA病毒，病毒粒子直徑50 65nm,核衣殼25 35nm,表面有明顯的纖突,核衣殼呈立體對稱的二十面體。該病毒屬于套式病毒目(Nidovirales),動脈炎病毒科(Arterivirus)。豬繁殖與呼吸綜合癥病毒基因組全長約15. 4kb,包括9個開放閱讀框架(Open Reading Frame, 0RF),分別編碼病毒復制所需要的酶(ORFla和ORFlb)和7個結構蛋白(0RF2a、0RF2b、0RF3 0RF7)。ORFla和ORFlb占基因組全長的3/4，編碼的多聚蛋白ppla和pplab最終可水解為14個非結構蛋白(Nonstructural Protein, NSP)。這些NSP編碼病毒RNA復制酶，是病毒產生的唯一的非結構性蛋白，參與病毒復制。按照歐洲型豬繁殖與呼吸綜合癥病毒Lelystad株各非結構蛋白劃分，Nsp7的起止位置為Ser 2083 Glu 2351。北美洲型豬繁殖與呼吸綜合癥病毒VR-2332株Nsp7的起止位置為Ser 2200 Glu2458氨基酸。我國流行的豬繁殖與呼吸綜合癥病毒主要是北美洲型，主要為高致病性HuM株，由于HuM株較VR-2332株在Nsp2處存在30個氨基酸的缺失，所以HuM株Nsp7的起止位置為Ser 2170 Glu 2428。Nsp7共259個氨基酸，由777個堿基編碼。研究顯示Nsp7可誘導機體產生高水平的抗體，并能維持較長時間，說明Nsp7與機體免疫應答關系密切。0RF5編碼主要的囊膜糖蛋白GP5，0RF2 0RF4分別編碼次要結構蛋白GP2a、GP2b、GP3和GP4，GP5與0RF6編碼的基質蛋白M形成二聚體，核衣殼蛋白(N蛋白)由0RF7編碼。其中，N蛋白在病毒粒子中含量較高，是病毒的優(yōu)勢結構蛋白，約占病毒蛋白總量的20% 40%，同時抗原性最強且具有較好的保守性。豬繁殖與呼吸綜合癥病毒感染后機體首先產生的是針對N蛋白抗體，并且在體內持續(xù)時間最長，因而該蛋白已 作為檢測豬繁殖與呼吸綜合癥病毒血清抗體的診斷抗原。豬繁殖與呼吸綜合癥的診斷技術包括以下幾種(I)臨床癥狀及病理變化即通過臨床表現(xiàn)及組織病理改變進行診斷，如發(fā)熱、咳嗽、呼吸急促等呼吸系統(tǒng)癥狀，耳部肢體發(fā)紺，繁殖豬早產、流產泌乳不足，公豬精液品質下降，仔豬易死亡等。該方法并非特異性診斷方法。(2)病毒的分離培養(yǎng)和檢查通過細胞培養(yǎng)觀察病毒誘導的細胞病變。該方法需要特定的實驗條件，且實驗周期長。(3)分子或細胞生物學診斷采用PCR、原位核酸雜交、間接免疫熒光試驗、間接免疫過氧化物酶試驗等直接檢測感染病豬中的豬繁殖與呼吸綜合癥病毒核酸或抗原。但分子生物學檢測操作復雜繁瑣，對儀器設備、實驗室條件、以及實驗人員的技術要求高，檢測成本亦相應增加，因此難以在基層單位大規(guī)模開展；此外，豬繁殖與呼吸綜合癥病毒具有抗原變異性的特點，也使得傳統(tǒng)的單一抗原檢測難以達到預期目的。(4)免疫學診斷常用的方法如免疫過氧化物酶單層試驗(IPMA)、間接熒光抗體試驗(IFA)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)、血清中和試驗(SN)等。其中ELISA在國內外被廣泛應用于豬繁殖與呼吸綜合癥病毒抗體檢測。主要原因是由于它有明顯優(yōu)于其它幾種方法的優(yōu)點操作簡單，穩(wěn)定性好，可自動顯示結果，特異性敏感性高。對實驗室及儀器設備的要求相對較低，易于實現(xiàn)高通量檢測，是適于在基層單位推廣的檢測方法。豬繁殖與呼吸綜合癥病毒的基因結構和抗原性比較復雜，并且具有抗原變異性的特點，使得單一抗原檢測或通過單一抗原檢測抗體均難以達到理想的靈敏度。全病毒作為包被抗原的優(yōu)點是抗原制作方法比較簡單，缺點是病毒純化工藝復雜，費時、費力、成本高，全病毒抗原建立的ELISA檢測時有較強的背景反應和非特異性反應，以及不同批次差異較大，有散毒的隱患等。使用完整的病毒顆粒作為標準抗原雖然可具備理想的靈敏度，抗原制作方法也比較簡單，但是需要進行病毒培養(yǎng)、滅活、以及滅活后的驗證等復雜工藝，費時、費力、成本高，全病毒抗原建立的ELISA檢測時有較強的背景反應和非特異性反應，以及不同批次差異較大，具有潛在病毒傳播風險的隱患等，這些缺點使得該方法并不適合產業(yè)化開發(fā)；此外，完整的病毒顆粒作為抗原檢測抗體，還容易出現(xiàn)假陽性結果。利用基因工程技術制備重組抗原代替全病毒抗原進行ELISA檢測，可避免使用全病毒抗原檢測的不足，其優(yōu)點在于目的蛋白的反應特異性高，且一旦技術路線成熟，可大量穩(wěn)定的制備。構建多重表位融合抗原是目前檢測豬繁殖與呼吸綜合癥病毒抗體最為理想的策略。基于
現(xiàn)有技術，在對豬繁殖與呼吸綜合癥病毒各蛋白氨基酸序列進行了充分的生物信息學分析的基礎上，我們采用多重表位融合抗原(Multiple-epitope fusionantigen, MEFA)技術,選取了 Nsp7與N蛋白部分殘基作為抗原優(yōu)勢表位進行融合抗原的設計與制備，這兩部分均可誘導機體產生高水平的抗體，并能維持較長時間。以此多重表位融合抗原作為捕獲抗原建立了檢測豬繁殖與呼吸綜合癥病毒抗體的間接ELISA方法，再經過條件的優(yōu)化使得在達到一定產能(4，8000頭份/周)的前提下，該方法所需的各組分都具備了相當?shù)姆€(wěn)定性，從而成功研制出了豬繁殖與呼吸綜合癥病毒抗體檢測試劑盒。
技術實現(xiàn)思路
本專利技術的目的是提供一種檢測豬繁殖與呼吸綜合癥病毒血清抗體的多重表本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種檢測豬繁殖與呼吸綜合癥病毒血清抗體的多重表位融合抗原，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ？ID？NO:1所示。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發(fā)人員：黃洪濤，嚴俊，姚靜，石延賓，張憲，胡偉，江雨麗，李小魚，魏勇，
申請(專利權)人：重慶業(yè)為基生物科技有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：
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