本發明專利技術公開了一種用于防治棉鈴疫病的短小芽孢桿菌(Bacillus?pumilus)菌株HMB22277，已于2011年12月20日保藏于中國微生物菌種保藏管理中心，保藏編號為CGMCC?No.5615。本發明專利技術還公開了利用該微生物生產的微生物菌劑及其制備方法，其活性成分為短小芽孢桿菌HMB22277菌體和它的胞外代謝產物。本發明專利技術短小芽孢桿菌HMB22277對棉鈴疫病針對性強，而且防效高，平均防效在77％以上；其次，本發明專利技術微生物菌劑對人、畜安全，沒有環境污染問題；也不易產生抗藥性；此外本發明專利技術微生物菌劑制備方法簡單、成本低、使用方便。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于農業微生物領域，具體涉及一種用于防治棉鈴疫病的短小芽孢桿菌和含有該短小芽孢桿菌的微生物菌劑，以及它們在防治棉鈴疫病上的應用。
技術介紹
棉鈴疫病是一種嚴重的棉花病害，由芒麻疫霉(Phytophthora boehmeriaesawada)引起，它不僅直接為害棉鈴，而且為其它病原菌提供了侵染條件。防治棉鈴疫病的方法主要是推株并壟、早摘爛鈴等栽培措施和化學藥劑防治。目前，我國種植棉花的經濟效益較低，而且人工費較高，農民不愿投入太多精力來推株并攏；早摘爛鈴只能保住部分產量，不足以防控棉鈴疫病；化學藥劑雖然防治效果較好，但存在容易產生抗藥性，化學藥劑價格較貴，增加生產成本，以及環境污染等問題。因此，亟需尋找一種省時省力、高效并且成 本低廉的防治方法。利用有益微生物對植物病害進行生物防治，因具有針對性強、防效高且環保等優點越來越受到重視。特別是在蔬菜氣傳病害和作物土傳病害上應用較多。有關棉鈴疫病的生物防治方面研究很少。馬平等(馬平等.生物防治通報.1993.9(3))發現木霉菌和腐霉菌對棉鈴疫病具有一定防治效果，并篩選到生防細菌MB-3和MB-7，其發酵液10倍稀釋液對棉鈴疫病田間防治效果分別為34. 9%和45. 4% (馬平等 中國生物防治 1998. 14(2))。芽孢桿菌(Bacillus)具有分布廣、易分離培養、能產生抗逆性較強的芽孢、貯藏期長和使用方便等優點，是一種理想的生防微生物，相比其他類型的生防因子，更有利于菌劑的生產，劑型加工，在環境中存活、定殖與繁殖。因此，篩選對病原菌具有抑制作用的芽孢桿菌是防治有關植物病害的最有效方法之一。
技術實現思路
本專利技術目的在于提供一種用于防治棉鈴疫病的短小芽孢桿菌菌株，該菌株具有高效、廣譜殺菌活性等優點。本專利技術第二目的在于提供一種微生物菌劑。本專利技術第三目的在于提供上述微生物菌劑的制備方法。本專利技術第四目的在于提供上述短小芽孢桿菌菌株在防治棉鈴疫病上的用途。本專利技術第五目的在于提供上述微生物菌劑在防治棉鈴疫病上的用途。本專利技術通過以下技術方案實現一種短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)菌株HMB22277，已于2011年12月20日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No. 5615。利用上述短小芽孢桿菌HMB22277生產的微生物菌劑，其活性成分為短小芽孢桿菌HMB22277菌體和它的胞外代謝產物。上述微生物菌劑可以為液體制劑。上述微生物菌劑的制備方法，包括如下步驟菌種活化，種子液制備和發酵培養。上述微生物菌劑的制備方法，具體包括如下步驟(I)菌種活化將低溫保存的HMB22277菌株在LB平板培養基上活化，挑取單菌落在LB斜面培養基上30°C培養24 36小時，得活化的菌株；(2)種子液制備用無菌的接種環刮取一環步驟(I)活化的菌株接種到IOOmLLB液體培養基中，在26 34°C、，搖床轉速為170 210rpm的條件下培養22 25小時，得種子液；(3)發酵培養按照體積比為0. 5% 3. 0%的比例將步驟⑵的種子液接入到蔗糖豆餅粉培養基(PH值為5. 8 6. 2)中，在溫度為28 34°C，搖床轉速為170 210rpm的條件下發酵培養36 54h ;所述的蔗糖豆餅粉培養基，其組成成分及其重量百分比為蔗糖2.0 3. 0%，豆餅粉 I. 6 2. 4%, NaCl 0. I 0. 2%, CaCO3O. I 0. 3%, KH2PO4 0. 01 0.03%和 MgSO4 7H20 0. 01 0. 03%，其余為水；(4)檢測發酵液中菌體和芽孢的數量，待發酵液中成熟芽孢占到芽孢和菌體總數的90%時，停止發酵培養；所得即為HMB22277菌株的液體制劑。上述制備方法步驟(2)和(3)中所述的溫度優選為30 32°C ;所述的搖床轉速優選為210rpm ;所述的培養時間優選為48h。所述的LB平板培養基、LB斜面培養基和LB液體培養基均按照常規方法制備。所述的蔗糖豆餅培養基的制備方法，按照重量百分比將蔗糖、豆餅粉、NaCl、CaCO3> KH2PO4和MgSO4 7H20混合，再加水，攪拌均勻即可。上述微生物菌劑，其短小芽孢桿菌HMB22277的活菌數大于8. 37X 108cfu/mL。上述短小芽孢桿菌HMB22277在防治棉鈴疫病上的應用。上述微生物菌劑在防治棉鈴疫病上的應用。本專利技術微生物菌劑的使用方法將上述所得微生物菌劑用水稀釋至活菌數為107cfu/mL，于棉鈴疫病發病前進行棉鈴表面、中下部葉片噴霧，即可達到控制棉鈴疫病的目的。HMB22277菌株的篩選分離過程HMB22277菌株是河北省農林科學院植物保護研究所從河北省定興縣黃瓜田土壤中分離得到的。2010年河北省農林科學院植物保護研究所從河北省保定市定興縣黃瓜田中五點取樣采土壌，混勻后稱取5g放到250mL的滅菌三角瓶中，加入IOOmL無菌水,放到搖床上，170r/min振蕩30min，靜置2h，取上清液ImL加無菌水9mL，即成IOmL 10_2倍土壤微生物懸液，繼而將土壤懸液稀釋成10_3、10_4、10_5、10_6倍稀釋液，各濃度取200 u L微生物懸液涂于LB和KB培養基平板上，每個濃度3次重復，在28°C恒溫培養ld_3d，進行細菌的分離和純化。并以棉鈴疫病為靶標，利用平板對峙法和離體成鈴針刺接種法進行生防菌的篩選。結果從中篩選出ー個對靶標病害具有明顯防治效果的菌株，定名為HMB22277。HMB22277菌株的分類鑒定(I)形態特征鑒定在LB培養基上培養菌體為桿狀，培養IOh后產生芽孢，芽孢中生，橢圓形，孢囊不膨大，抗酸染色陰性，無伴孢晶體，能運動，鞭毛周生。在營養瓊脂平板上，培養初期菌落淡乳白色，膿狀，圓形，邊緣整齊，菌落隆起呈饅頭狀，表面濕潤；培養后期菌落淡黃色，邊緣不整齊，表面干燥有褶皺；在營養瓊脂斜面上劃線培養，呈直線形；在液體培養基中、靜止培養，表面形成白色菌膜。與《常見細菌系統鑒定手冊》(東秀珠等編著.科學出版社.2001年)中描述的芽孢桿菌屬形態特征基本一致，初步判斷菌株HMB22277屬于芽孢桿菌(Bacillus)。(2)利用16S rDNA序列鑒定分類以HMB22277的基因組DNA為模板，以F27和R1492為引物對16S rDNA進行PCR擴增，所述的引物序列為F27 5，AGAGTTTGATCATGGCTCAG3，； (SEQ ID No 2)R1492 :5’ GGCTACCTTGTTACGACTT3’ ； (SEQ ID No 3) 16S rDNA 的擴增反應體系為 50 y L:10XPCR Buffer (Mg2+) 5 u L ； dNTPMixture(2. 5mM) 5 u L ；Taq(5U/u L) I u L, F27(10 u mol/L) I u L, R1492(10 u mol/L)luL ；HMB22277的基因組DNA 50ng ；ddH20補足至50 yしPCR的反應條件為95 °C 5min ；95°C 30s, 55°C 30s, 72°C I. 5min，30個循環；72°C lOmin。將所得PCR擴增產物進行凝膠電本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種短小芽孢桿菌(Bacillus？pumilus)菌株HMB22277，已于2011年12月20日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC？No.5615。
【技術特征摘要】
1.一種短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)菌株HMB22277，已于2011年12月20日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No. 5615。2.利用權利要求I所述的短小芽孢桿菌HMB22277生產的微生物菌劑，其特征在于其活性成分為短小芽孢桿菌HMB22277菌體和它的胞外代謝產物。3.按照權利要求2所述的微生物菌劑，其特征在于為液體制劑。4.按照權利要求2所述的微生物菌劑，其特征在于短小芽孢桿菌HMB22277的活菌數大于 8. 37X 108cfu/mL。5.權利要求2所述的微生物菌劑的制備方法，具體包括如下步驟 (1)將低溫保存的HMB22277菌株在LB平板培養基上活化，挑取單菌落在LB斜面培養基上30°C培養24 36小時，得活化的菌株； (2)用無菌的接種環刮取一環步驟(I)活化的菌株接種到IOOmLLB液體培養基中，在26 34°C、，搖床轉速為170 210rpm的條件下培養22 25小時，得種子液； (3)按照體積比為0.5% 3. 0%的比例將...
【專利技術屬性】
技術研發人員：李寶慶，馬平，李社增，鹿秀云，郭慶港，
申請(專利權)人：河北省農林科學院植物保護研究所，
類型：發明
國別省市：
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