本發明專利技術涉及利用電化學核酸適配體傳感器快速一步檢測赭曲霉毒素Ａ的方法。所述方法的具體操作步驟如下：（1）裸金電極表面的拋光處理，（2）適配體電化學傳感器的修飾；（3）對赭曲霉毒素A標準濃度溶液進行檢測，建立標準曲線；（4）對含赭曲霉毒素A的實際樣品溶液進行定量檢測。本發明專利技術提高了檢測赭曲霉毒素的靈敏性，最低可以檢測出0.01pg/mL的赭曲霉毒素A；大大降低了檢測目標毒素的成本，操作簡單方便；僅需5～10min就可以實現一步檢測出赭曲霉毒素A。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于食品檢測
，具體涉及食品中赭曲霉毒素A的檢測方法。
技術介紹
赭曲霉毒素A廣泛存在自然界中，其毒性強，對人類和動植物損害極大。赭曲霉毒素A是由多種生長在糧食(小麥、玉米、大麥、燕麥、黑麥、大米和黍類等)、花生、蔬菜(豆類)等農作物上的曲霉和青霉等產生。動物攝入了霉變的飼料后，這種毒素也可能出現在豬和母雞等的肌肉組織中。赭曲霉毒素A主要侵害動物肝臟與腎臟。這種毒素主要是引起腎臟損傷，大量的毒素也可能引起動物的腸黏膜炎癥和壞死。在動物試驗中觀察到它的致畸作用。 赭曲霉毒素A毒性很強，并且廣泛存在于各種食物、谷物及其副產品中。為了保障人類的健康，非常有必要開展食品中赭曲霉毒素A的檢測研究。赭曲霉毒素A的含量通常很低，所以對檢測手段的要求較高，檢測OTA的定性方法有微柱法，定量分析方法有薄層色譜法、高效薄層色譜法、HPLC、酶聯免疫吸附法和熒光比色法等。薄層層析法的優點是方法簡單，使用的試劑價格便宜，但是存在靈敏度較差，所需試劑繁多，檢測周期長，重現性不好和無法實現自動化等缺點，已不能滿足現代檢測的要求。色譜法可以定性、定量，但是儀器昂貴，操作復雜且不適合用于大批量樣品的檢測，而且不能用于現場的快速檢測。現場快速篩選方法以酶聯免疫吸附法較多。但這種方法是基于抗原-抗體的親和反應，以抗體作為識別分子。由于抗體容易受到外界環境尤其是溫度的影響，限制了方法的靈活應用。此外，抗體制備也需經過動物實驗或者細胞實驗，繁瑣費時，制備成本高，檢測的成本也高。所以有必要發展一種快速方便，檢測成本低，檢測靈敏度高的新型檢測方法。
技術實現思路
為了解決現有赭曲霉毒素A檢測成本高、檢測方案復雜、檢測時間過長的缺點，本專利技術提供一種利用電化學核酸適配體傳感器一步快速檢測赭曲霉毒素A的方法。具體的技術解決方案如下在有赭曲霉毒素A存在的情況下，本專利技術中所述適配體與赭曲霉毒素A特異性結合，引起核酸適配體的空間結構變化，進一步影響核酸適配體上修飾的電化學活性物質亞甲基藍與電極表面電子傳遞的速率，從而影響電化學活性物質亞甲基藍的氧化還原峰電流值，通過電化學活性物質亞甲基藍顯示的氧化還原峰電流值與赭曲霉毒素A濃度之間的線性變化關系，建立赭曲霉毒素A的一步快速電化學傳感器檢測新方法。本專利技術利用電化學核酸適配體傳感器一步快速檢測赭曲霉毒素A方法的具體操作步驟如下 (I).裸金電極表面的拋光處理 將裸金電極在濃度0. 3 mmol/L的氧化鋁粉末水溶液中打磨拋光處理5min，再在濃度0.05 mmol/L的氧化鋁粉末水溶液中打磨拋光處理5 min，然后在無水乙醇溶液中超聲清洗5 min，最后在去離子水中超聲清洗5 min，徹底除去非特異性吸附在裸金電極表面的氧化招粉末； (2).適配體電化學傳感器的修飾 取ImL濃度I mmol/L的三(P-氯乙基)磷酸酯，加入到99 mL濃度為lmmol/L的赭曲霉毒素A核酸適配體溶液中，室溫下活化孵育30 min，得到活化的赭曲霉毒素A核酸適配體溶液；取6 mL濃度lmmol/L活化的赭曲霉毒素A核酸適配體溶液，滴加在步驟(I)拋光處理后的裸金電極表面，溫度30°C條件下孵育2h，得到赭曲霉毒素A核酸適配體修飾的電極；用去離子水清洗赭曲霉毒素A核酸適配體修飾的電極2 3次，得到清洗過的電極；將清洗過的電極浸沒在200mL濃度2mmol/L的6-巰基己醇中，并在溫度30°C條件下封閉4h，得到表面封閉過的電極，用去離子水清洗表面封閉過的電極，即得用于一步法檢測赭曲霉毒素A的電化學核酸適配體傳感器； 赭曲霉毒素A核酸適配體為單鏈DNA探針，所述單鏈DNA探針的序列從5’端到3’端為 GAT CGG GTG TGG GTG GCG TAA AGG GAG CAT CGG ACA，所述單鏈 DNA 探針的 3’ 末端修飾了巰基，5’末端修飾了電化學活性物質亞甲基藍； 濃度為lmmol/L的赭曲霉毒素A核酸適配體溶液是3’末端修飾了巰基和5’末端修飾了亞甲基藍的DNA適配體探針溶液； (3).對赭曲霉毒素A標準濃度溶液進行檢測，建立標準曲線 將電化學核酸適配體傳感器作為工作電極，銀/氯化銀(Ag/AgCl)電極作為參比電極，鉬絲電極作為對電極，置于10 mL濃度100 mmol/L的Tris-HCl緩沖液中，Tris-HCl緩沖液的PH值為7. 4，在Tris-HCl緩沖液中加入濃度為lmg/L的赭曲霉毒素A標準溶液，得到含有赭曲霉毒素A濃度0. 01pg/mL的溶液,置入所述工作電極,室溫孵育反應5 IOmin ；掃描方波伏安圖譜，掃描高電位為0 V，低電位為-0.4 V，頻率50 Hz，電位增量為0.001 V，振幅為0. 05 V,得到含有赭曲霉毒素A濃度為0. 01pg/mL的氧化還原峰圖譜及其氧化還原峰電流； 同理，在含有赭曲霉毒素A濃度0.01pg/mL的溶液中接著加入濃度為lmg/L赭曲霉毒素A標準溶液分別得到含有赭曲霉毒素A的終濃度為0. lpg/mL的溶液A、含有赭曲霉毒素A的終濃度為I pg/mL的溶液B、含有赭曲霉毒素A的終濃度為10 pg/mL的溶液C、含有赭曲霉毒素A的終濃度為100pg/mL的的溶液D，所述溶液A、溶液B、溶液C和溶液D為四種標準液；將工作電極分別依次置入四種標準液中，分別反應5 IOmin ;分別掃描四種標準液的方波伏安圖譜并記錄相應的氧化還原峰電流值；以含有赭曲霉毒素A濃度0. 01pg/mL的溶液和四種標準液對應的氧化還原峰峰電流值作為縱坐標，以含有0. 01pg/mL的赭曲霉毒素A溶液的濃度和四種標準赭曲霉毒素A溶液的濃度作為橫坐標,建立赭曲霉毒素一步法檢測的標準曲線； (4).對含赭曲霉毒素A的實際樣品溶液進行定量檢測 將作為工作電極的電化學核酸適配體傳感器浸沒在10 mL濃度為100 mmol/L的Tris-HCl緩沖液中，Tris-HCl緩沖液的pH值為7. 4，在Tris-HCl緩沖液中加入含有未知濃度的赭曲霉毒素A溶液,反應5 10 min,掃描方波伏安圖譜,掃描高電位為0 V，低電位為-0.4 V，頻率50 Hz，電位增量為0. 001V，振幅0. 05 V ;得到特定濃度赭曲霉毒素對應的氧化還原峰峰電流值，通過所述赭曲霉毒素一步法檢測標準曲線，計算出所述未知濃度的赭曲霉毒素A溶液中赭曲霉毒素A的濃度。檢測赭曲霉毒素A所用的生物傳感器,是對目標赭曲霉毒素A敏感并將其濃度轉換為電信號進行檢測的儀器。是由固定化的生物敏感材料作識別探針(包括酶、抗體、抗原、微生物、細胞、組織、核酸等生物活性物質)與適當的理化換能器(如氧電極、光敏管、場效應管、壓電晶體等等)及信號放大裝置構成的分析工具或系統。核酸適配體是通過指數富集配體的系統計劃技術篩選而來的。與抗體相比，核酸適配體具有易合成、易修飾、易固定、可反復使用和長期保存的優點。電化學核酸適配體傳感器在快速檢驗中發揮著重要作用，它將電化學信號傳導的高靈敏性和核酸適配體的高親和性相結合。電化學核酸適配體傳感器制備簡便、易修飾、靈敏高、測試費用低、適于聯機化、穩定性好和結合目標物范圍廣等優點。本專利技術解決了赭曲霉毒素A檢測成本高，檢測方案復雜，檢測時間過長的缺點。本專利技術采用可特本文檔來自技高網...
【技術保護點】
利用電化學核酸適配體傳感器一步快速檢測赭曲霉毒素Ａ的方法，其特征在于所述方法的具體操作步驟如下：（1）.裸金電極表面的拋光處理將裸金電極在濃度0.3？mmol/L的氧化鋁粉末水溶液中打磨拋光處理5min，再在濃度0.05？mmol/L的氧化鋁粉末水溶液中打磨拋光處理5？min，然后在無水乙醇溶液中超聲清洗5？min，最后在去離子水中超聲清洗5？min，徹底除去非特異性吸附在裸金電極表面的氧化鋁粉末；（2）.適配體電化學傳感器的修飾：取1mL濃度1？mmol/L？的三(β？氯乙基)磷酸酯，加入到99？mL濃度為1mmol/L的赭曲霉毒素A核酸適配體溶液中，室溫下活化孵育30？min，得到活化的赭曲霉毒素A核酸適配體溶液；取6？mL濃度1mmol/L活化的赭曲霉毒素A核酸適配體溶液，滴加在步驟（1）拋光處理后的裸金電極表面，溫度30℃條件下孵育2h，得到赭曲霉毒素A核酸適配體修飾的電極；用去離子水清洗赭曲霉毒素A核酸適配體修飾的電極2～3次，得到清洗過的電極；將清洗過的電極浸沒在200mL濃度2mmol/L？的6？巰基己醇中，并在溫度30℃條件下封閉4h，得到表面封閉過的電極，用去離子水清洗表面封閉過的電極，即得用于一步法檢測赭曲霉毒素A的電化學核酸適配體傳感器；赭曲霉毒素A核酸適配體為單鏈DNA探針，所述單鏈DNA探針的序列從5’端到3’端為GAT？CGG？GTG？TGG？GTG？GCG？TAA？AGG？GAG？CAT？CGG？ACA，所述單鏈DNA探針的3’末端修飾了巰基，5’末端修飾了電化學活性物質亞甲基藍；濃度為1mmol/L的赭曲霉毒素A核酸適配體溶液是3’末端修飾了巰基和5’末端修飾了亞甲基藍的DNA適配體探針溶液；（3）.對赭曲霉毒素A標準濃度溶液進行檢測，建立標準曲線：將電化學核酸適配體傳感器作為工作電極，銀/氯化銀（Ag/AgCl）電極作為參比電極，鉑絲電極作為對電極，置于10？mL濃度100？mmol/L？的Tris？HCl緩沖液中，Tris？HCl緩沖液的pH值為7.4，在Tris？HCl緩沖液中加入濃度為1mg/L的赭曲霉毒素A標準溶液，得到含有赭曲霉毒素A濃度0.01pg/mL的溶液，置入所述工作電極，室溫孵育反應5～10min；掃描方波伏安圖譜，掃描高電位為0？V，低電位為？0.4？V，頻率50？Hz，電位增量為0.001？V，振幅為0.05？V，得到含有赭曲霉毒素A濃度為0.01pg/mL的氧化還原峰圖譜及其氧化還原峰電流；同理，在含有赭曲霉毒素A濃度0.01pg/mL的溶液中接著加入濃度為1mg/L赭曲霉毒素A標準溶液分別得到含有赭曲霉毒素A的終濃度為0.1pg/mL的溶液A、含有赭曲霉毒素A的終濃度為1？pg/mL的溶液B、含有赭曲霉毒素A的終濃度為10？pg/mL的溶液C、含有赭曲霉毒素A的終濃度為100pg/mL的的溶液D，所述溶液A、溶液B、溶液C和溶液D為四種標準液；將工作電極分別依次置入四種標準液中，分別反應5～10min；分別掃描四種標準液的方波伏安圖譜并記錄相應的氧化還原峰電流值；以含有赭曲霉毒素A濃度0.01pg/mL的溶液和四種標準液對應的氧化還原峰峰電流值作為縱坐標，以含有0.01pg/mL的赭曲霉毒素A溶液的濃度和四種標準赭曲霉毒素A溶液的濃度作為橫坐標，建立赭曲霉毒素一步法檢測的標準曲線；？（4）.對含赭曲霉毒素A的實際樣品溶液進行定量檢測：將作為工作電極的電化學核酸適配體傳感器浸沒在10？mL濃度為100？mmol/L？的Tris？HCl緩沖液中，Tris？HCl緩沖液的pH值為7.4，在Tris？HCl緩沖液中加入含有未知濃度的赭曲霉毒素A溶液，反應5～10？min，掃描方波伏安圖譜，掃描高電位為0？V,？低電位為？0.4？V，頻率50？Hz，電位增量為0.001V，振幅0.05？V；得到特定濃度赭曲霉毒素對應的氧化還原峰峰電流值，通過所述赭曲霉毒素一步法檢測標準曲線，計算出所述未知濃度的赭曲霉毒素A溶液中赭曲霉毒素A的濃度。...
【技術特征摘要】
1.利用電化學核酸適配體傳感器一步快速檢測赭曲霉毒素A的方法，其特征在于所述方法的具體操作步驟如下 (1).裸金電極表面的拋光處理 將裸金電極在濃度0. 3 mmol/L的氧化鋁粉末水溶液中打磨拋光處理5min，再在濃度.0.05 mmol/L的氧化鋁粉末水溶液中打磨拋光處理5 min，然后在無水乙醇溶液中超聲清洗.5 min，最后在去離子水中超聲清洗5 min，徹底除去非特異性吸附在裸金電極表面的氧化招粉末； (2).適配體電化學傳感器的修飾 取ImL濃度I mmol/L的三(P-氯乙基)磷酸酯，加入到99 mL濃度為lmmol/L的赭曲霉毒素A核酸適配體溶液中，室溫下活化孵育30 min，得到活化的赭曲霉毒素A核酸適配體溶液；取6 mL濃度lmmol/L活化的赭曲霉毒素A核酸適配體溶液，滴加在步驟(I)拋光處理后的裸金電極表面，溫度30°C條件下孵育2h，得到赭曲霉毒素A核酸適配體修飾的電極；用去離子水清洗赭曲霉毒素A核酸適配體修飾的電極2 3次，得到清洗過的電極；將清洗過的電極浸沒在200mL濃度2mmol/L的6-巰基己醇中，并在溫度30°C條件下封閉4h，得到表面封閉過的電極，用去離子水清洗表面封閉過的電極，即得用于一步法檢測赭曲霉毒素A的電化學核酸適配體傳感器； 赭曲霉毒素A核酸適配體為單鏈DNA探針，所述單鏈DNA探針的序列從5’端到3’端為 GAT CGG GTG TGG GTG GCG TAA AGG GAG CAT CGG ACA，所述單鏈 DNA 探針的 3’ 末端修飾了巰基，5’末端修飾了電化學活性物質亞甲基藍； 濃度為lmmol/L的赭曲霉毒素A核酸適配體溶液是3’末端修飾了巰基和5’末端修飾了亞甲基藍的DNA適配體探針溶液； (3).對赭曲霉毒素A標準濃度溶液進行檢測，建立標準曲線 將電化學核酸適配體傳感器作為工作電極，銀/氯化銀(Ag/AgCl)電極作為參比電極，鉬絲電極作為對電極，置于10 mL濃度100 mmol/L的Tris-H...
【專利技術屬性】
技術研發人員：陳偉，吳晶晶，薛峰，梅占龍，張睿，陳寒清，蔣原，
申請(專利權)人：合肥工業大學，
類型：發明
國別省市：
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