本發明專利技術公開了一對用于快速檢測葡萄潰瘍病菌Neofusicoccum?parvum菌種的引物及其應用。該對引物，它們的核苷酸序列分別為序列表中序列1和序列表中序列2，能夠在葡萄潰瘍病菌Neofusicoccum?parvum特異性的擴增出370bp的產物，對Neofusicoccum?parvum菌種基因組DNA的靈敏度可達10pg。這表明該引物對可以用于田間葡萄病樣中Neofusicoccum?parvum菌種的快速可靠的檢測和鑒定，克服傳統鑒定方法步驟繁瑣、鑒定周期長等問題。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及一對葡萄潰瘍病菌Neofusicoccum parvum菌種快速分子檢測引物及其應用。
技術介紹
葡萄潰瘍病(Grape Botryosphaeriaceae Canker)是由葡萄座腔菌科(Botryosphaeriaceae)真菌侵染引起的一種病害，近年來在世界范圍內危害日益加重， 在埃及、美國、匈牙利、意大利、葡萄牙、西班牙、南非和中國等14個國家均有發生并造成了嚴重的損失。目前，已知葡萄座腔菌科中的15個種能夠引起該病害(Auger J, EsterioM,Ricke G，et al. Black dead arm and basal canker of Vitis vinifera cv. Red Globecaused by Botryosphaeria obtusa in Chile . Plant Disease. 2004, 88(11):1286.Niekerk J M，Fourie P H，Hallenn F，et al. Botryosphaeria spp.as grapevinetrunk disease pathogens . Phytopathologia Mediterranea. 2006，45(4):43-54.U Rbez-Torres J R，Peduto F，Striegler R K，et al.Characterization of fungalpathogens associated with grapevine trunk diseases in Arkansas and Missouri.Fungal Diversity. 2012:1-21. U Rbez-Torres J R，Gubler W D.Pathogenicity ofBotryosphaeriaceae species isolated from grapevine cankers in California.Plant Disease. 2009，93 (6) : 584-592.)，在我國已發現并報道的葡萄潰瘍病病原菌有 Botryosphaeria dothidea、Lasiodiplodia theobromae 和 Diplodia seriata 三個種(Li X H，Yan JY, Kong F F，et al. Botryosphaeria dothidea causing canker ofgrapevine newly reported in China . Plant Pathology.2010, 59 (6):1170. YanJ Y，Peng Y L，XieY，et al. First Report of Grapevine Trunk Disease Caused byBotryosphaeria obtusa in China. Plant Disease. 2011, 95 (5):616. Yan J Y，Li XH，Kong F F，et al. Occurrence of Grapevine Trunk Disease Caused by Botryosphaeriarhodina in China Plant Disease. 2011，95 (2):219.Yan JY, XieY, Yao S W, etal.Characterization of Botryosphaeria dothidea, the causal agent of grapevinecanker in China. Australasian Plant Pathology. 2012，41:351-357.)。現階段對于病原菌真菌的鑒定，以常規的形態學鑒定為主，但由于葡萄潰瘍病菌種類繁多且種間形態差異較小，使得傳統鑒定方法耗時耗力，迫切需要現代分子技術手段解決該問題。近年來，以聚合酶鏈式反應(Polymerase chain reaction，PCR)技術為平臺的病原生物分子檢測技術，已被廣泛應用于動植物病害的診斷及病原菌的鑒定。但在葡萄潰瘍病菌檢測方面，國內至今還未有分子檢測技術的系統研究。葡萄潰瘍病菌的快速檢測技術，有助于了解我國葡萄潰瘍病菌的種群分布，對葡萄潰瘍病的有效防治及葡萄抗病品種的選育等方面有指導作用
技術實現思路
本專利技術的目的是提供一對葡萄潰瘍病菌Neofusicoccum parvum菌種特異性分子檢測引物以及特異性強、靈敏度高、易于操作、結果可靠的葡萄潰瘍病菌的快速分子檢測方法。本專利技術所提供的快速檢測葡萄潰瘍病菌Neofusicoccum parvum菌種的引物,名稱為B. p-F/B. p-R，它們的核苷酸序列分別為序列表中序列I和序列表中序列2。本專利技術還提供一種快速檢測葡萄潰瘍病菌Neofusicoccum parvum菌種的試劑盒，包括上述引物。所述試劑盒還可以包括PCR反應試劑盒。PCR反應試劑盒可以從商業途徑獲得，也可以自己配置。 本專利技術還提供利用上述檢測引物B. p-F/B. p-R檢測葡萄潰瘍病菌Neofusicoccumparvum菌種的方法,包括以下步驟I)提取待測樣品DNA，以該DNA為模板，用權利要求I所述的引物進行PCR擴增；2)鑒定步驟I)所述的PCR擴增產物的大小，將擴增產物中含有一個370bp的DNA特異性擴增片段的待測樣品鑒定為含有Neofusicoccum parvum菌種的樣品。PCR反應體系為25ii L，包括待測樣品DNA (約5ng)，上游正向引物和下游反向引物(10iimol/L)各0. L(即終濃度為 0. 2iimol/L)，dATP、dCTP、dGTP、dTTP 的終濃度均為 2. 5mmol/L, 2. 5 u L10父？0 緩沖液(100_01/1 Tris-HCl pH8. 3, 500mmol/LKCl, 15mmol/L MgCl2)和 0. 25 y LTaq DNA聚合酶(5U/iiL，添加終濃度為0.05U/iil)，其余部分用ddH20補足；PCR 條件為94°C預變性 4min ；30 個循環的 94°C 45s，61。。30s 和 72°C 30s ；72°C延伸IOmin0步驟2)中所述鑒定步驟1)PCR擴增產物的大小的方法是取5 ii L PCR產物用質量百分濃度為I. 2%瓊脂糖凝膠電泳分離，經溴化乙錠染色后于紫外燈下根據有無擴增產物判定結果。擴增產物中含有一個370bp的DNA片段的待測葡萄潰瘍病菌(Botrysphoraeriaspp.)菌株為屬于Neofusicoccum parvum菌種的菌株。所述待測樣品DNA采用NaOH法提取，DNA提取步驟如下I)將待測樣品稱重后，每mg樣品加入30 ii L 0. 5mol/LNa0H溶液，充分研磨；2)將步驟I)研磨后的樣品離心取上清液，每IOii L上清液加入490 ii L 0. ImmoI/LpH8. 0的Tris-HCl，混勻后得到待測樣品DNA，直接用于PCR反應。上述引物可應用于篩選引起葡萄潰瘍病的病原菌,特別是篩選葡萄座腔菌屬菌種Neofusicoccum parvum,而且可本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一對引物，它們的核苷酸序列分別為序列表中序列1和序列表中序列2。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：張瑋，李興紅，燕繼曄，嚴紅，
申請(專利權)人：北京市農林科學院，
類型：發明
國別省市：
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