本發明專利技術公開了一種豬鏈球菌2型莢膜多糖抗體的酶聯免疫試劑盒及應用，所述的試劑盒還包括抗原酶標板、稀釋液A、脫脂奶粉、陽性對照、陰性對照、洗滌液、羊抗豬酶標二抗、顯色液A、顯色液B、終止液；抗原酶標板是以豬鏈球菌2型莢膜多糖作為抗原；陽性對照為豬鏈球菌2型菌免疫過的豬陽性對照血清；洗滌液含有Tween-20的PBS緩沖液；終止液含有氫氟酸溶液；顯色液A含有過氧化氫脲的檸檬酸鹽緩沖液，顯色液B液含TMBpH5.0的檸檬酸/檸檬酸鈉緩沖液；稀釋液A含有Tween-20的PBS緩沖液。試劑盒在檢測豬鏈球菌2型莢膜多糖抗體的酶聯免疫中的應用。豬鏈球菌2型莢膜多糖的使用，特異性好，靈敏度高。檢測時間短，一般2個小時內即可出結果。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及動物疫病檢測，具體涉及一種豬鏈球菌2型莢膜多糖抗體的酶聯免疫試劑盒，同時還涉及一種豬鏈球菌2型莢膜多糖抗體的酶聯免疫試劑盒的用途，適用于檢測豬血清中的豬鏈球菌2型的莢膜多糖的抗體水平。
技術介紹
豬鏈球菌(streptococcus suis)是一種能引起人、豬和其他動物感染、發病的重要致病菌。根據莢膜多糖分型，豬鏈球菌有35個血清型，即1/2型和1-34型(后來研究認為32和34型屬于Streptococcus orisratti)。其中豬鏈球菌2型(SS2)是毒力最強、流行最廣的血清型。國外自1968年荷蘭首次報道人感染腦膜炎病例以來已有200多人因感 染豬鏈球菌死亡。在我國，自七十年代以來該病在全國二十多個省市已發生或流行，造成了不同程度的經濟損失。2005年6 8月間，四川省資陽市、內江市等地區暴發流行豬鏈球菌2型病，并導致204人感染，38人死亡。在其它省市也有零星發生。由此可見，該病在我國廣泛存在并嚴重流行，已成為當前嚴重危害養豬業發展的一種主要疾病，不僅給養豬業造成巨大經濟損失，而且給人類也造成了嚴重的危害。為了有效地預防和控制豬鏈球菌2型病，在加強免疫預防的同時，使用特異、敏感、快速、便于操作的診斷和檢測方法，為有效預防和控制豬鏈球菌2型的發生提供有力的手段和重要的工具。本專利技術應用提取的豬鏈球菌2型的莢膜多糖及ELISA檢測技術，使試劑盒具有很好的敏感性和特異性，能大通量的檢測豬血清中的豬鏈球菌2型莢膜多糖的抗體。
技術實現思路
本專利技術的目的是在于提供了一種豬鏈球菌2型莢膜多糖抗體的酶聯免疫試劑盒，該試劑盒的優點是使用了豬鏈球菌2型的莢膜多糖作為抗原，使試劑盒的檢測具有良好的靈敏性和特異性。本專利技術的另一個目的是在于提供了一種豬鏈球菌2型莢膜多糖抗體的酶聯免疫試劑盒在檢測豬鏈球菌2型莢膜多糖抗體的酶聯免疫中的應用，將提取的豬鏈球菌2型莢膜多糖作為抗原包被于聚苯乙烯微孔板上，然后加待檢血清孵育，再加入羊抗豬酶標抗體(購自Southern biotechnology associates (SBA)),顯色時應出現兩種情況,如果待檢血清是陽性，那么此時加入的羊抗豬酶標抗體就會繼續與陽性血清中的抗體反應，酶標儀檢測數值就會越高。如果是待檢血清陰性，那么羊抗豬酶標抗體就不會與ELISA板上豬鏈球菌2型莢膜多糖抗原反應，得到的數值就會低。該試劑盒特異性好、敏感性高。目前國內還無同類商業化的產品。有著良好的應用前景。為了實現上述的目的，本專利技術采用以下技術措施一種豬鏈球菌2型莢膜多糖抗體的酶聯免疫的試劑盒，包括豬鏈球菌2型莢膜多糖包被的抗原酶標板。所述的試劑盒還包括抗原酶標板、稀釋液A、脫脂奶粉(市售伊利奶粉)、陽性對照、陰性對照、洗滌液、羊抗豬酶標二抗、顯色液A、顯色液B、終止液。所述的抗原酶標板是以豬鏈球菌2型莢膜多糖作為抗原，在包被聚苯乙烯微孔板時用O. lmol/L, pH9. 6的碳酸氫鈉溶液作為包被緩沖液。所述的豬鏈球菌莢膜多糖是從豬鏈球菌2-LT株(CCTCC NO M2011282)中提取所得，所述的豬鏈球菌2-LT株已于2011年8月9日保藏在中國典型培養物保藏中心，CCTCC NO :M2011282。(專利申請號:201110234192. 9)所述的陽性對照為豬鏈球菌2型菌免疫過的豬陽性對照血清，所述的陰性對照為未感染過和未免疫過豬鏈球菌的健康豬陰性血清。所述的洗滌液為含有O. 05% (體積比)Tween-20的PBS緩沖液；所述的終止液為含O. 25%體積比氫氟酸溶液。 所述的顯色液A為含有50mg/mL過氧化氫脲的檸檬酸鹽緩沖液，顯色液B液為含有O. 2mg/mL TMB pH5. O的檸檬酸/檸檬酸鈉緩沖液。所述的稀釋液A為含有O. 05%體積比Tween-20的PBS緩沖液。一種豬鏈球菌2型莢膜多糖的制備方法，其制備過程是溶菌酶處理與冷酚提取相結合。具體分為兩步一、使用改良的溶菌酶處理法(林樹乾等，金黃色葡萄球菌莢膜多糖的制備及生物學特性，家畜生態學報，第27卷第6期)，將滅活的豬鏈球菌2型菌液使用滅菌生理鹽水洗三遍，再用原菌液1/10體積的O. 01mol/L PBS將其重懸，加入終濃度O. lmol/L的甘氨酸，并加入終濃度3mg/L溶菌酶(購自北京普博欣生物科技有限公司)，置37°C下過夜(8 10小時)，室溫14000r/min離心45分鐘，收集上清，再加入終濃度為25%的無水乙醇和終濃度為O. lg/L的CaCl2，置2 8°C下作用2小時，12000r/min離心10分鐘，收集上清，然后加入終濃度為80%的無水乙醇，置2 8°C下作用12小時，12000r/min離心10分鐘，得到的沉淀即為粗制莢膜多糖。二、用冷酚處理法(林樹乾等，金黃色葡萄球菌莢膜多糖的制備及生物學特性，家畜生態學報，第27卷第6期)，將粗制多糖進行純化。將得到的粗制多糖用IOml飽和醋酸鈉重懸，加入預冷的苯酚，快速振搖30分鐘，8°C 4000r/min離心，收集上清液，重復三次，再將所得的的上清液裝入透析袋用lmol/L的NaCl溶液透析48小時，收集透析內液，然后加入終濃度為55%的無水乙醇，置2 8°C下作用24小時，12000r/min離心10分鐘，取沉淀干燥后用IOmlPBS溶解，即為精制莢膜多糖。一種豬鏈球菌2型莢膜多糖抗體的酶聯免疫的試劑盒在檢測豬鏈球菌2型莢膜多糖抗體的酶聯免疫中的應用，其步驟是I)將脫脂奶粉溶于稀釋液A中，使其脫脂奶粉的終濃度為5%，作為待檢血清和對照血清的稀釋液。2)取抗原包被板(包被有豬鏈球菌2型莢膜多糖抗原的檢測板)，先用稀釋好的洗滌液洗板2次，再將稀釋好的待檢血清、陰性對照血清和陽性對照血清各取100 μ I加入到抗原包被板孔中。待檢血清設I孔，陰性對照和陽性對照各設2孔。輕輕振勻孔中樣品(勿溢出)，置37°C下溫育30分鐘。3)棄去孔中的溶液，每孔加入稀釋好的洗滌液200 μ 1，靜置3分鐘后，棄去洗滌液，并在吸水紙上拍干，重復洗板5次，最后一次在吸水紙上拍干。4)每孔加羊抗豬酶標二抗100 μ 1，置37°C下溫育30分鐘后洗板5次(方法同步驟3)。5)每孔加顯色液A、顯色液B各一滴(約50 μ L)，混勻，室溫(18 25°C，以下相同)避光顯色10分鐘。每孔加終止液一滴(約50 μ L)，10分鐘內用酶標儀測定每孔0D630nm讀值。本專利技術試劑盒判定標準為在酶標儀上測各孔0D630nm值，試驗成立的條件是；陽性對照孔0D630nm值均應彡O. 8，且< 2. O ;陰性對照孔0D630nm值均應< O. 3。如果樣品0D630nm值彡O. 35，判為陽性；如果樣品00630_值< O. 35，則判為陰性。本專利技術具有以下優點和效果 I.目前國內還無同類商業化的產品2.由于豬鏈球菌2型莢膜多糖的使用，特異性好，靈敏度高。3.操作簡單，檢測時間短，一般2個小時內即可出結果；附圖說明圖I為一種用苯酚硫酸法測定莢膜多糖時繪制的標準曲線示意圖。圖中橫坐標為糖濃度，縱坐標為OD值。圖2為一種使用分光光度計對莢膜多糖進行質量檢測示意圖。圖中橫坐標為波長，縱坐標為吸光值。具體實施例方式為了使本專利技術更加容易理解，下面本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種豬鏈球菌2型莢膜多糖抗體的酶聯免疫試劑盒，包括豬鏈球菌2型莢膜多糖包被的抗原酶標板，其特征在于：所述的試劑盒還包括抗原酶標板、稀釋液A、脫脂奶粉、陽性對照、陰性對照、洗滌液、羊抗豬酶標二抗、顯色液A、顯色液B、終止液；所述的抗原酶標板是以豬鏈球菌2型莢膜多糖作為抗原，在包被聚苯乙烯微孔板時用0.1mol/L，pH9.6的碳酸氫鈉溶液作為包被緩沖液；所述的陽性對照為豬鏈球菌2型菌免疫過的豬陽性對照血清；所述的陰性對照為未感染過和未免疫過豬鏈球菌的健康豬陰性血清；所述的洗滌液為含有0.05%體積比Tween？20的PBS緩沖液；所述的終止液為含0.25%體積比氫氟酸溶液；所述的顯色液A為含有50mg/mL過氧化氫脲的檸檬酸鹽緩沖液，顯色液B液為含有0.2mg/mL？TMB？pH5.0的檸檬酸/檸檬酸鈉緩沖液；所述的稀釋液A為含有0.05%體積比Tween？20的PBS緩沖液。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：康超，金梅林，徐高原，郭學波，董曉暉，肖圣建，
申請(專利權)人：武漢科前動物生物制品有限責任公司，華中農業大學，
類型：發明
國別省市：
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