本發明專利技術涉及對蝦白斑綜合癥病毒多價載體疫苗及其應用。所述多價載體疫苗是含有對蝦白斑綜合癥病毒囊膜蛋白VP19基因片段或VP28基因片段的重組鰻弧菌，所述重組鰻弧菌的細胞表面有VP19蛋白或VP28蛋白存在。本發明專利技術以一株非致病性鰻弧菌野生株HT5301作為載體菌株，以該菌株制備的疫苗具有保護對蝦免受鰻弧菌侵染的能力，同時它并沒有鰻弧菌的致病性但保留了對對蝦的侵襲力，可通過浸泡和口服方式給藥，實現自然注射效果的接種目的，彌補了單一效價和給藥不方便的技術應用缺陷，使用簡單方便，為對蝦白斑綜合癥病毒病和弧菌病的防治提供了一種多效價、安全和經濟的疫苗。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及載體疫苗技術，具體地說是對蝦白斑綜合癥病毒(WSSV)多價載體疫苗及其應用，屬于基因生物工程
具體地說是表面展示對蝦白斑綜合癥病毒抗原蛋白的鰻弧菌重組載體疫苗及應用。
技術介紹
對蝦是主要在亞洲和拉丁美洲特別為出口目的生產的高價值水產品，目前主要的養殖品種為南美白對蝦、斑節對蝦和中國對蝦，其中南美白對蝦已成為我國目前養殖量最大的對蝦品種，年產量達70余萬噸，位居世界第一。然而在過去的近20年里，主要由于弧菌病和病毒病，對蝦養殖生產中出現了相當嚴重的問題，其中白斑綜合癥病毒(White spotsyndrome virus, WSSV)、桃拉病毒(Taura Syndrome Virus, TSV)和弧菌為重要病害兀兇。對全球對蝦養殖業來說，白斑綜合癥病毒被認為是最為嚴重的病毒病原之一，毎年的白斑 病發病率高達40%以上，并可在3-10天內造成全球毎年高達30億美元的對蝦病害損失。我國所有對蝦養殖區域基本都已爆發了日趨嚴重的白斑病。細菌重大病害主要為弧菌屬病原引發的弧菌病(Vibriosis)，危害全球所有養殖對蝦品種，多發于6-9月間。在蝦苗孵育階段臨床癥狀主要表現為發光，腸道破壞，病害爆發時可一夜間導致100%死亡率。這些重大病害已成為我國和全球對蝦養殖業健康可持續發展的嚴重制約因素。白斑綜合癥病毒(WSSV)是引起對蝦白斑病的元兇，它屬Nimaviridae科Whispovirus屬的代表種,是ー種無包涵體、有囊膜的桿狀病毒(van Hulten, et al. 2001.Virology. 286(1) : 1-22)。它能高致死率地侵染絕大多數種類的對蝦，此外還可以侵染淡水及海洋生態中的多種蟹類、龍蝦類、端足類等甲殼綱動物，具有較廣泛的宿主范圍，給水產養殖造成嚴重的經濟損失。因此針對對蝦白斑綜合癥病毒的防治技術開發受到廣泛關注。近年的研究表明，白斑綜合癥病毒(WSSV)的重組囊膜蛋白可以誘導對蝦產生抗病保護效應。目前，國內外在研究WSSV疫苗上取得了很大的進展。已研發的包括有核酸類疫苗(Rout N，et al. 2007. Vaccine. 25:2778-2786;Rajeshkumar S，et al. 2009. 26(3) :429-437等)和重組疫苗(Witteveldt J, et al. 2004b. J Virol. 78:2057-2061 ;ffitteveldt J, etal. 2004a. Fish Shellfish Immunol. 16:571-579;Mavichak R. et al. 2010.J FishDis. 33:69-74等)。Witteveldt J等發現VP28的亞單位疫苗對對蝦免受WSSV的感染起到重要的保護作用，其免疫保護率達到70%。除此以外，Yu Mi Ha等人發現WSSV的囊膜蛋白VP19在 WSSV 侵染對蝦時起到重要作用(Yu Mi Ha, et al. 2008. J Env Bio, 29 (4) : 513-517)。寧德剛等人(D. Ning, et al. 2011 Journal of Applied Microbiology 111: 1327-1336)通過基于Cot衣殼蛋白基因展示系統將VP28蛋白展示到枯草芽孢桿菌的表面，通過ロ服的方式免疫龍蝦，其免疫保護率達到80%。2011年美國Harrisvaccine公司證明在注射的條件下VP19的免疫保護率要優于VP28，VP19的免疫保護率是70%而VP28的免疫保護率是40% Cj. Dustion Loy, DVM global aquaculture advocate May/June 2011)。而 JeroenWitteveldt通過研究發現，VP19和VP28在不同的給藥方式下，其免疫保護率是有區別的，在注射的條件下VP19的免疫保護率高于VP28 ;在ロ服的條件下VP28的免疫保護率高于VP19 ;當兩個共同作用的時候其免疫保護效果要低于單個使用。基于上述前人的研究結果，本專利技術使用的WSSV的抗原蛋白是VP28和VP19。但目前的研究工作也存在著很多不足之處，其中ー個主要方面在于現有研究エ作所使用的細菌載體非常単一，主要為枯草芽孢桿菌，世界范圍內，以天然無毒或人工減毒的水產病原菌為載體進行對蝦多價載體疫苗開發還處于空白。以病原細菌的天然無毒或人工減毒株為活菌載體，借助細菌的外膜定位元件對來源于其他病原微生物(包括細菌、病毒)的多種抗原因子進行細菌展示，從而誘導產生針對兩種以上病原體的多重免疫應答，是開發高效多價的載體疫苗的理想途徑，以此展示并導入抗原的策略在疫苗設計方面具有獨特的優勢(I)通過細菌展示的多肽抗原更易被免疫系統識別；(2)細菌的外膜蛋白、脂多糖和分泌的毒素具有強免疫原性，可作為所展示外源蛋白的免疫佐劑，從而激發機體產生更為強烈和持久的免疫應答；(3)通過展示不同類型的抗原因子可以產生多效價的疫苗；(4)活菌載體本身保持了對宿主的侵入能力，可以通過浸泡或ロ服完成免疫過程，從而使得免疫方式更為簡單和有效；(5)疫苗的生產只需通 過細菌大規模培養即可實現，成本低廉并且操作簡單。冰核蛋白INP是ー種發現于歐氏桿菌、假單胞菌和黃單胞菌屬的膜蛋白，在過冷水中，它能促進冰晶的形成。冰核蛋白可以分為三個結構功能域N端結構域(N_Terminaldomain)、C端結構域(C-Terminaldomain)及中央結構域(Centraldomain)。其N端和C端結構域分別由175個和49個氨基酸組成，被認為是具有外膜定位功能的元件。冰核蛋白表面展示系統被認為是迄今以來最為理想的異源蛋白展示系統(Lee YP, Chung GH,Rhee JS. 2003. Trends Biotechnol 21:45-52)，其優點包括穩定的表達和外膜轉運能力；內部重復單位長度可調整，從而調節外源蛋白和膜表面之間的距離；通過冰晶核形成活性試驗可檢測異源蛋白是否表達在細胞表面；表達INP融合蛋白不影響膜的結構和宿主細胞生長。為此，本專利技術基于上述多效價載體疫苗開發思想，結合INP表面展示技術和無毒病原菌活載體的優點，將對蝦白斑綜合癥病毒抗原蛋白展示到鰻弧菌表面制備可以保護對蝦免于鰻弧菌和白斑綜合癥病毒雙重侵染的多價載體疫苗。同時通過表面展示方法可以使多肽抗原更加穩定，更利于被免疫系統識別(Jeong, H. S. et al. 2001. Enzyme Microbiol.Technol. 28:155-160.)。本專利技術所使用的鰻弧菌是ー株天然的非致病性鰻弧菌，以該菌株制備的疫苗具有保護對蝦免受鰻弧菌侵染的能力，同時它并沒有鰻弧菌的致病性但保留了對對蝦的侵襲力，可通過浸泡方式實現自然注射效果的接種目的。綜上所述，本專利技術的目的在于提供一種可預防對蝦白斑綜合癥和弧菌病的多價載體疫苗。其中以INP表面展示方法制備白斑綜合癥病毒VP19和VP28的載體疫苗迄今尚未見任何類似的報道或專利技術專利。使用鰻弧菌作為載體菌株制備對蝦多價載體疫苗也未見文獻報道。
技術實現思路
本專利技術的目的在于克服現有技術中存在的不足，提供一種對蝦白斑綜合癥病毒多價載體疫苗及本文檔來自技高網...
【技術保護點】
對蝦白斑綜合癥病毒多價載體疫苗，其特征在于：所述多價載體疫苗是含有對蝦白斑綜合癥病毒囊膜蛋白VP19基因片段或VP28基因片段的重組鰻弧菌，所述重組鰻弧菌的細胞表面有VP19蛋白或VP28蛋白存在。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：不公告發明人，
申請(專利權)人：無錫海健生物科技有限公司，
類型：發明
國別省市：
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