變體枯草桿菌蛋白酶（枯草桿菌酶）制造技術

對卵污漬具有改良的洗滌性能的新的枯草桿菌酶。這些枯草桿菌酶當用于例如清潔或洗滌劑組合物，如洗衣組合物和洗盤組合物，包括自動洗盤組合物中時對卵污漬具有優秀的或者改進的洗滌性能。（*該技術在2024年保護過期，可自由使用*）

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及對污潰，尤其卵污潰具有改良性能的新枯草桿菌酶(subtilase)。當這些枯草桿菌酶用于如清潔或洗滌劑組合物，如洗衣組合物和洗盤組合物中，包括自動洗盤組合物中時，對卵污潰表現出優良的或改進的性能。本專利技術也涉及編碼該枯草桿菌酶的分離的多核苷酸、核酸構建體、重組表達載體、包含該核酸構建體的宿主細胞，以及生產和使用本專利技術的枯草桿菌酶的方法。而且,本專利技術涉及包含本專利技術枯草桿菌酶的清潔和洗滌劑組合物，以及這些酶在洗滌劑組合物中的用途 和用于除去卵污潰的用途。
技術介紹
在洗滌劑工業，酶已在洗滌配方中使用了 30年以上。用于這些配方的酶包括蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、纖維素酶、甘露糖苷酶和其它酶或它們的混合物。商業上最為重要的酶是蛋白酶。數量不斷增長的商用蛋白酶是天然存在的野生型蛋白酶的蛋白質工程化變體，如 DURAZYM (Novozymes A/S)、RELASE (NovozymesA/S)、MAXAPEM (Gist-Brocades N. V.) >PURAFECT (Genencor International, Inc.)。此夕卜，本領域，如EP130756 (GENENTECH)(對應于美國重新發行(Reissue)專利號 34，606 (GENENCOR));EP 214435 (HENKEL) ;W087/04461 (AMGEN) ;W087/05050(GENEX);EP 260105(GENENCOR);Thomas, Russell,和 Fersht(1985)Nature318375-376;Thomas, Russell,和 Fersht(1987)J. Mol. Biol. 193 803-813;Russel和 Fersht Nature 328496-500 (1987) ;W0 88/08028 (Genex) ;W088/08033 (Amgen) ;W0 95/27049 (S0LVAY S.A.) ;WO 95/30011 (PROCTER&GAMBLE COMPANY) ;WO95/30010 (PROCTER&GAMBLE COMPANY) ;W095/29979 (PR0CTER&GAMBLEC0MPANY) ;US 5.543.302 (S0LVAY S.A.) ;EP 251446 (GENENCOR) ;W089/06279 (NOVOZYMES A/S);W091/00345(NOVOZYMES A/S);EP 525610A1(SOLVAY);W0 94/02618(GIST-BROCADESN. V.)中描述了許多蛋白酶變體。在WO 02/42740 (NOVOZYMES A/S)中描述了用于篩選(AMSA)的試驗方法。WO 01/75087 (MAXYGEN, INC. /NOVOZYMES A/S)描述了枯草桿菌蛋白酶同系物，其改進了多種特定性質，包括熱穩定性、低溫下的活性和堿性穩定性。WO 01/68821 (NOVOZYMES A/S)描述了枯草桿菌酶，其適于從例如衣物和/或硬表面除去卵污潰。然而,盡管已經描述了許多有用的蛋白酶和蛋白酶變體,仍然需要對許多工業用途進一步改進蛋白酶或蛋白酶變體。具體地，由于存在于卵白中的物質抑制許多絲氨酸蛋白酶這一事實，從例如衣物或者硬表面除去卵污潰的問題已經變得突出。因此，本專利技術的一個目的是提供改良的枯草桿菌酶，其適于例如從衣物或者硬表面除去卵污潰。專利技術概述從而，一方面，本專利技術涉及對卵污潰具有改良的洗滌性能的枯草桿菌酶，所述枯草桿菌酶選自(a)枯草桿菌酶，其氨基酸序列與SEQ ID NO: 2的氨基酸I到269所示氨基酸序列具有99. 26%以上同一性；和 (b)枯草桿菌酶，其由克隆到大腸桿菌(Escherichia coli)MT173 DSM15575中存在的質粒片段的編碼枯草桿菌酶的多核苷酸部分編碼，或者與所述枯草桿菌酶具有至少99. 26%同一性的所述枯草桿菌酶的變體；和(C)枯草桿菌酶，其氨基酸序列與SEQ ID NO:4的氨基酸I到269所示氨基酸序列具有97. 40%以上同一性；和(d)枯草桿菌酶，其由克隆到大腸桿菌MT173 DSM 15574中存在的質粒片段的編碼枯草桿菌酶的多核苷酸部分編碼，或者與所述枯草桿菌酶具有97. 40%以上同一性的所述枯草桿菌酶的變體。在第二方面，本專利技術涉及分離的多核苷酸，其含有編碼本專利技術的枯草桿菌酶的核酸序列。在第三方面，本專利技術涉及編碼枯草桿菌酶的分離的多核苷酸，其選自(a)與SEQ ID NO: I的核苷酸I到807所示核酸序列具有至少88%同一性的多核苷酸；和(b)已經克隆到大腸桿菌MT173 DSM 15575中存在的質粒的多核苷酸的枯草桿菌酶編碼部分，或者所述核酸序列的與該核酸序列具有至少88%同一性的變體，(c)與SEQ ID NO: 3的核苷酸I到807所示核酸序列具有至少88%同一性的多核苷酸；和Cd)已經克隆到大腸桿菌MT173 DSM 15574中存在的質粒的多核苷酸的枯草桿菌酶編碼部分，或者所述核酸序列的與該核酸序列具有至少88%同一性的變體。在第四方面，本專利技術涉及核酸構建體，其含有根據本專利技術的核酸序列，其有效連接到指導枯草桿菌酶在適宜的宿主中表達的一個或多個控制序列。在第五方面，本專利技術涉及重組表達載體，其含有根據本專利技術的核酸構建體、啟動子、轉錄和翻譯終止信號。在第六方面，本專利技術涉及重組宿主細胞，其含有本專利技術的核酸構建體。在第七方面，本專利技術涉及產生根據本專利技術的枯草桿菌酶的方法，該方法包括(a)在有助于產生枯草桿菌酶的條件下培養重組宿主細胞；和(b)回收枯草桿菌酶。在第八方面，本專利技術涉及清潔或洗滌劑組合物，優選洗衣和洗盤組合物，其含有本專利技術的枯草桿菌酶。本專利技術還涉及I.枯草桿菌酶，其選自(a)枯草桿菌酶，其氨基酸序列與SEQ ID NO: 2的氨基酸I到269所示氨基酸序列具有99. 26%以上同一性；或(b)枯草桿菌酶，其由克隆到大腸桿菌(Escherichia coli)MT173DSM 15575中存在的質粒片段的編碼枯草桿菌酶的多核苷酸部分編碼，或者與所述枯草桿菌酶具有99. 26%以上同一丨I生的所述枯草桿菌酶的變體；或(c)枯草桿菌酶，其氨基酸序列與SEQ ID NO: 4的氨基酸I到269所示氨基酸序列具有97. 40%以上同一性；或(d)枯草桿菌酶，其由克隆到大腸桿菌MT173 DSM 15574中存在的質粒片段的編碼枯草桿菌酶的多核苷酸部分編碼，或者與所述枯草桿菌酶具有97. 40%以上同一性的所述枯草桿菌酶的變體。 2.根據項I的枯草桿菌酶,其具有I)與Ia)或者Ib)中描述的氨基酸序列具有99. 26%以上，或者99. 63%以上同一性的氨基酸序列；或者II)與Ic)或者Id)中描述的氨基酸序列具有97. 40%以上，或者97. 77%以上，或者98. 14%以上，或者98. 51%以上，或者98. 89%以上，或者99. 26%以上，或者99. 63%以上同一性的氨基酸序列。3.根據項2的枯草桿菌酶，其由SEQ ID NO:2的氨基酸I到269所示氨基酸序列組本文檔來自技高網...

【技術保護點】
枯草桿菌酶用于除去卵污漬的用途，所述枯草桿菌酶為氨基酸序列為SEQ？ID？NO:2的氨基酸1到269所示的枯草桿菌酶或者在SEQ？ID？NO:2的氨基酸1到269中經過替換一個或多個氨基酸而由SEQ？ID？NO:2的氨基酸1到269衍生的枯草桿菌酶，其顯示出改進的洗滌性能，其中所述替換選自根據BASBPN編號的如下位置：27、36、56、76、87、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、120、123、159、167、170、206、218、222、224、232、235、236、245、248、252和274。

【技術特征摘要】
2003.05.07 DK PA2003006901.枯草桿菌酶用于除去卵污潰的用途，所述枯草桿菌酶為氨基酸序列為SEQID NO:2的氨基酸I到269所示的枯草桿菌酶或者在SEQ ID NO: 2的氨基酸I到269中經過替換一個或多個氨基酸而由SEQ ID N0:2的氨基酸I到269衍生的枯草桿菌酶，其顯示出改進的洗滌性能，其中所述替換選自根據BASBPN編號的如下位置27、36、56、76、87、95、96、97、98、99、.100、101、102、103、104、120、123、159、167、170、206、218、222、224、232、235、236、245、248、.252 和 274。2.根據權利要求I的枯草桿菌酶的用途，其中所述替換選自根據BASBPN編號的K27R、*36D、S56P、N76D、S87N、G97N、S101G、S103A、V104A、V104I、V104N、V104Y、H120D、N123S、G159D、Y167、R170、Q206E、N218S、M222S、M222A、T224S、A232V、K235L、Q236H、Q245R、N248D、N252K 和 T274A。3.清潔或盤洗滌的、洗滌硬表面或者衣物的方法，所述方法包括將硬表面或者衣物與清潔或洗滌劑組合物接觸，所述清潔或洗滌劑組合物包含氨基酸序列為SEQ ID NO:2的氨基酸I到269所示的枯草桿菌酶或者在SEQ ID NO: 2的氨基酸I到269中經過替換一個或多個氨基酸而由SEQ ID NO:2的氨基酸I到269衍生的枯草桿菌酶，其顯示出改進的洗滌性能，其中所述替換選自根據BASBPN編號的如下位置27、36、56、76、87、95、96、97、98、99、.100、101、102、103、104、120、123、159、167、170、206、218、222、224、232、235、236、245、248、.252 和 274。4.根據權利要求3的方法，其中所述替換選自根據BASBPN編號的K27R、*36D、S56P、N76D、S87N、G97N、S101G、S103A、V104A、V104I、V104N、V104Y、H120D、N123S、G159D、Y167、R170、Q206E、N218S、M222S、M222A、T224S、A232V、K235L、Q236H、Q245R、N248D、N252K 和T274A。5.從硬表面或者衣物除去卵污潰的方法，所述方法包括將含有卵污潰的硬表面或者含有卵污潰的衣物與清潔或洗滌劑組合物接觸，所述清潔或洗滌劑組合物包含氨基酸序列為SEQ ID NO: 2的氨基酸I到269所示的枯草桿菌酶或者在SEQ ID NO: 2的氨基酸I到269中經過替換一個或多個氨基酸而由SEQ ID NO: 2的氨基酸I到269衍生的枯草桿菌酶，其顯示出改進的洗滌性能，其中所述替換選自根據BASBPN編號的如下位置27、36、56、76、87、95、.96、97、98、99、100、101、102、103、104、120、123、159、167、170、206、218、222、224、232、235、.236、245、248、252 和 274。6.根據權利要求5的方法，其中所述替換選自根據BASBPN編號的K27R、*36D、S56P、N76D、S87N、G97N、S101G、S103A、V104A、V104I、V104N、V104Y、H120D、N123S、G159D、Y167、R170、Q206E、N218S、M222S、M222A、T224S、A232V、K235L、Q236H、Q245R、N248D、N252K 和T274A。7.枯草桿菌酶，其選自 (a)枯草桿菌酶，其氨基酸序列與SEQID NO: 2的氨基酸I到269所示氨基酸序列具有.99. 26%以上同一性；或 (b)枯草桿菌酶，其由克隆到大腸桿菌(Escherichiacoli)MT173DSM 15575中存在的質粒片段的編碼枯草桿菌酶的多核苷酸部分編碼，或者與所述枯草桿菌酶具有99. 26%以上同一'I生的所述枯草桿菌酶的變體；或 (c)枯草桿菌酶，其氨基酸序列與SEQID NO: 4的氨基酸I到269所示氨基酸序列具有.97.40%以上同一性；或 (d)枯草桿菌酶，其由克隆到大腸桿菌MT173DSM 15574中存在的質粒片段的編碼枯草桿菌酶的多核苷酸部分編碼，或者與所述枯草桿菌酶具有97. 40%以上同一性的所述枯草桿菌酶的變體。8.根據權利要求7的枯草桿菌酶，其具有 I)與Ia)或者Ib)中描述的氨基酸序列具有99.26%以上，或者99. 63%以上同一性的氨基酸序列；或者 II)與Ic)或者Id)中描述的氨基酸序列具有97.40%以上，或者97. 77%以上，或者.98.14%以上，或者98. 51%以上，或者98. 89%以上，或者99. 26%以上，或者99. 63%以上同一性的氨基酸序列。9.根據權利要求8的枯草桿菌酶，其由SEQID NO:2的氨基酸I到269所示氨基酸序列組成，或者由SEQ ID NO:4的氨基酸I到269所示氨基酸序列組成。10.根據權利要求7的枯草桿菌酶，其具有 I)與克隆到大腸桿菌MT173DSM15575中存在的質粒片段的多核苷酸的枯草桿菌酶編碼部分編碼的枯草桿菌酶具有99. 26%以上，或者99. 63%以上同一性的氨基酸序列；或者 II)與克隆到大腸桿...

【專利技術屬性】
技術研發人員：S米寧，JCF克內澤，NH澤倫森，JE內斯，MD韋爾奇，LJ吉韋爾，J徹麗，T維德爾博爾歇特，JS米舒爾，
申請(專利權)人：諾維信公司，麥克西根公司，
類型：發明
國別省市：