用于檢測抗天然人白細胞抗原抗體的組合物和方法技術

本披露提供了包含天然和變性人白細胞抗原（HLA）的組合物和制備所述組合物的方法。本披露還提供了檢測抗天然HLA抗體的方法和試劑盒。目前為止，天然HLA是所述組合物的主要組分，其通過在混合組合物中利用選擇性酶反應的方法富集天然HLA來制備。

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】用于檢測抗天然人白細胞抗原抗體的組合物和方法1.相關申請的交叉引用本申請要求美國臨時申請號61/338,258的優先權，其全部內容整體參考并入本文。2.專利
本披露提供的組合物和方法一般涉及組合物，例如用于檢測抗天然人白細胞抗原（HLA）的抗體的組合物，及其制備方法。3.
技術介紹
人白細胞抗原（Humanleukocyteantigens,HLA）能夠結合并展示人細胞表面的抗原至效應T細胞。兩類主要的HLA，I類和II類HLA，既提呈異體抗原也提呈天然抗原。I類HLA可以結合并提呈細胞內產生的肽抗原，包括病毒和腫瘤特異性蛋白，至CD8+效應T細胞（例如，細胞毒性T細胞（CytotoxicTcells,CTL））。在應對由含有I類HLA的細胞提呈的異體抗原時，CD8+效應T細胞能夠破壞提呈異體抗原的細胞。II類HLA能夠結合并提呈細胞外來源的肽抗原至CD4+T細胞（例如，輔助T細胞）。在應對由含有II類HLA的細胞提呈的異體抗原時，CD4+效應T細胞能夠支持體液免疫應答。HLA被認為在某些癌癥和自身免疫性疾病以及移植物排斥中發揮作用。HLA抗體通常由輸血、妊娠或移植導致的同種免疫產生。其也見于非同種免疫的個體。Morales-Buenrostro等,Transplantation86:1111-15(2008)。有研究顯示在移植受體中發現的HLA抗體是導致急性和慢性移植物排斥的一個原因。因此，確定受體中是否攜帶了抗供體HLA的抗體對確定受體中移植物排斥的風險可能是重要的。迄今為止，與HLA連接的底物一直用于HLA抗體的檢測。將來自受體的樣品與底物接觸，隨后采用常規技術檢測抗體與底物的結合。然而，常規底物通常與天然和變性HLA均連接。因此，這些底物在區分天然HLA抗體和變性HLA抗體的能力方面受到了限制。在某些情況下，抗天然HLA抗體而非抗變性HLA抗體對移植失敗具有預測性。Cai等,Transplantation88(2):226-31(2009)。因此需要這樣的組合物和方法，其能夠檢測抗天然HLA抗體同時又不受抗變性HLA抗體的干擾。此類組合物和方法可以用于防止潛在供體因假陽性信號而被排除，例如，當產生上述假陽性信號時，在受體中篩選抗供體HLA抗體時檢測到的其實是抗變性HLA的抗體。4.專利技術概述本披露提供了例如能夠檢測抗天然HLA抗體的組合物和方法。在第一個方面，本披露提供了一種包含天然和變性HLA的組合物，其中天然HLA的量較多。在某些實施方式中，至少90%的HLA是天然的，并且至多10%的HLA是變性的。在某些實施方式中，至少95%的HLA是天然的，并且至多5%的HLA是變性的。在某些實施方式中，至少99%的HLA是天然的，并且至多1%的HLA是變性的。在某些實施方式中，天然和變性HLA選自I類HLA、II類HLA及其組合。在某些實施方式中，HLA是I類HLA。在某些實施方式中，HLA是II類HLA。在某些實施方式中，HLA是I類和II類HLA的組合。天然和變性HLA可以屬于相同的等位基因或兩個或多個不同的等位基因。在某些實施方式中，至少90%的HLA屬于相同的等位基因。在某些實施方式中，至少95%的HLA屬于相同的等位基因。在其它實施方式中，至少99%的HLA屬于相同的等位基因。在某些實施方式中，天然和變性HLA連接至固體底物。可以通過本領域技術人員公知的任意技術將HLA與固體底物連接。在某些實施方式中，HLA與固體底物直接連接。在其它實施方式中，HLA與固體底物間接連接。固體底物可以由本領域技術人員公知的任意適宜材料制備。在某些實施方式中，固體底物包含選自二氧化硅、金、乳膠、聚苯乙烯、聚乙烯、聚砜、水凝膠、聚氯乙烯、玻璃及其組合的材料。此外，固體底物的形式可以是本領域技術人員認為適宜的任意形式。在某些實施方式中，固體底物選自數個珠子、數個微珠、數個微粒、數個微球、孔、膜、聚合物、濾片和微陣列及其組合。在某些實施方式中，固體底物是數個微珠。在某些實施方式中，固體底物包含一個可檢測標記。在某些實施方式中，可檢測標記包含熒光染料、放射性標記、磁標記或條碼。在某些實施方式中，可檢測標記是熒光染料。另一方面，本披露提供了包含數個固體底物的嵌板，其中數個固體底物中的每個各自與HLA連接，其中連接的HLA中的至少90%是天然的，并且至多10%的HLA是變性的，其中與數個特定固體底物連接的HLA中的至少90%屬于相同的等位基因，并且其中數個固體底物中的每個各自連接于與于其余數個固體底物不同的HLA。在某些實施方式中，HLA包含選自I類HLA、II類HLA及其組合的HLA。在某些實施方式中，數個包含4個固體底物、8個固體底物、16個固體底物或32個固體底物。另一方面，本披露提供了制備組合物的方法，所述組合物包含至少90%天然HLA和至多10%變性HLA。該方法包括：a）將包含天然和變性HLA的第一組合物在絲氨酸蛋白酶、脂肪酶、酯酶或酰胺酶消化變性HLA的條件下，與所述絲氨酸蛋白酶、脂肪酶、酯酶或酰胺酶接觸；以及b）中和所述絲氨酸蛋白酶、脂肪酶、酯酶或酰胺酶，以產生產物組合物，所述產物組合物包含至少90%天然HLA和至多10%變性HLA。在某些實施方式中，HLA懸浮于溶液中。在某些實施方式中，HLA與一個或多個固體底物連接。在特定實施方式中，HLA與數個微珠或微粒連接。在所述方法的某些實施方式中，HLA與絲氨酸蛋白酶接觸。在特定實施方式中，絲氨酸蛋白酶是胰蛋白酶。在某些實施方式中，HLA與脂肪酶接觸。在特定實施方式中，脂肪酶是磷脂酶。在某些實施方式中，HLA與酯酶接觸。在特定實施方式中，酯酶是乙酰膽堿酯酶。在其它實施方式中，酯酶是硫酯酶。在某些實施方式中，HLA與酰胺酶接觸。另一方面，本披露提供了篩選抗天然HLA抗體的方法。該方法包括以下步驟：a）將樣品與組合物接觸，其中組合物包含與固體底物連接的HLA，其中至少90%的HLA是天然的，且至多10%的HLA是變性的；以及b）檢測抗體與組合物的結合，其中抗體與組合物的結合表明存在抗天然HLA抗體。在某些實施方式中，樣品是生物樣品。在某些實施方式中，樣品來自于人類受試者。在某些實施方式中，樣品來自于人類受試者的血液樣品。抗體與組合物結合的檢測可以通過本領域技術人員公知的任意技術進行。在某些實施方式中，采用流式細胞術檢測抗體的結合。在某些實施方式中，采用二抗檢測抗體的結合。在特定實施方式中，二抗包含選自放射性標記、熒光標記、酶標記、親和素標記、生物素標記及其組合的標記。另一方面，本披露提供了檢測抗天然HLA抗體的試劑盒。這些試劑盒包括：a）包含與固體底物連接的HLA的組合物，其中至少90%的HLA是天然的，且至多10%的HLA是變性的，以及b）檢測抗體與組合物結合的試劑。在某些實施方式中，試劑包括二抗。在某些實施方式中，二抗包含可檢測標記，其選自放射性標記、熒光標記、酶標記、親和素標記、生物素標記及其組合。本披露提供的組合物和方法可以方便地檢測抗天然HLA的抗體，同時不會對抗變性HLA的抗體進行檢測。對天然HLA具有特異性的抗體的檢測在某些情況下是有用的，例如，當存在天然而非變性HLA的抗體時，HLA能預示移植失敗。在這些情況下，本披露提供的組合物和方法本文檔來自技高網...

【技術保護點】

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】2010.02.17 US 61/338,2581.制備包含至少90%天然人白細胞抗原和至多10%變性白細胞抗原的組合物的方法，其包含步驟：a.將包含天然和變性人白細胞抗原的第一組合物在胰蛋白酶消化所述變性人白細胞抗原的條件下，與所述胰蛋白酶接觸；以及b.中和所述胰蛋白酶，...

【專利技術屬性】
技術研發人員：P·I·泰薩奇，鄧純燦，A·伊迪卡，
申請(專利權)人：美國萊姆德有限公司，
類型：發明
國別省市：