用于增加Fc融合蛋白的血清半壽期的組合物和方法技術

本文提供了具有增加的血清半壽期的糖變體Fc融合蛋白。亦提供了通過引入一個或多個非內源糖基化位點來增加Fc融合蛋白的血清半壽期的方法。

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】用于増加Fe融合蛋白的血清半壽期的組合物和方法相關申請 本申請要求保護2009年12月2日提交的美國臨時申請號61/266，095和2010年4月23日提交的美國臨時申請號61/327，582的權益。上述申請的全部教導通過引用結合到本文中。
技術介紹
以其天然態或當重組產生時的治療用蛋白質或多肽通常為不穩 定的分子，表現出短時間的穩定性或短的血清半壽期。此外，這些分子在配制吋，特別是當在水溶液中配制用于診斷和治療目的時，常常極不穩定。存在少數實用的解決方案來延長或提高蛋白質治療分子的體內或體外穩定性。許多治療藥，特別是肽藥物受累于不適當的體內血清半壽期。這使在高頻和/或更高劑量給予所述治療藥，或者使用持續釋放制劑以維持療效所需的血清水平成為必需。頻繁的全身給藥與大量的消極副作用相關。例如，頻繁(例如毎日)全身注射表現出受試者的相當不舒適，造成高風險的給藥相關的感染，以及特別是當靜脈內給予治療藥時，可能需要住院治療或頻繁去醫院就診。此外，長期治療中的毎日靜脈內注射亦可導致大量的組織瘢痕形成和由反復穿刺血管引起的血管病理。對于治療劑的所有頻繁的全身給藥，例如給予糖尿病患者胰島素，或者在患有多發性硬化的患者中給予干擾素藥物，均已知類似問題。所有這些因素導致患者遵從性減小和用于衛生系統的費用増加。改變藥劑的血清半壽期的ー個可能的解決方案是與可増加半壽期的試劑分子共價連接。先前已顯示，聚合物例如聚こニ醇或“PEG”與多肽連接可増加它們的血清半壽期。然而，聚合物的連接可導致藥物活性減少。不完全連接或不一致連接導致產生具有不同性質的化合物的混合群體。此外，由這類修飾引起的半壽期改變為不可預知的。例如，不同的聚こニ醇與IL-8、G-CSF和IL-Ira綴合產生具有各種活性和半壽期的分子(Gaertner和Offord, (1996)，Bioconjugate Chem. 7:38-44)。IL-8 與 PEG2tl 綴合不引起其半壽期的改變，而PEG2tl與IL-Ira綴合引起在半壽期上幾乎増加至7倍。此外，IL-8/PEG20綴合物的效カ為天然蛋白質的1/10至1/20。因此，能夠增加生物活性分子的血清半壽期，而不會嚴重減少分子的生物學功能的方法將是極其需要的。專利技術概述 在某種程度上，本公開內容提供用于延長融合蛋白的血清半壽期的方法，所述融合蛋白包含免疫球蛋白Fe結構域和至少ー個異源多肽結構域。在某些實施方案中，所述方法包括通過修飾編碼最初Fe融合蛋白的異源部分的核酸以編碼一個或多個附加的N聯糖基化位點，來制備編碼修飾Fe融合蛋白的修飾核酸，所述修飾Fe融合蛋白相對于最初Fe融合蛋白具有延長的血清半壽期。在一些實施方案中，本專利技術的修飾核酸將編碼以下修飾Fe融合蛋白，當在合適細胞培養物中表達時，其血清半壽期比最初Fe融合蛋白的血清半壽期至少長10%。在一些實施方案中，本專利技術的修飾Fe融合蛋白相對于未修飾Fe融合蛋白具有基本上相同或更大的體內生物活性。在某些實施方案中，相對于缺乏附加糖基化位點的融合多肽的血清半壽期，在一個或多個附加(即引入的)糖基化位點的糖基化使修飾Fe融合蛋白的半壽期(例如，體外半壽期、體內半壽期、血清半壽期)増加至少10%、20%、30%、40%、50%、75%、100%、125%、150%、175%、200%、225%或250%或更多。在某些實施方案中，在相同的動物模型或物種中測定修飾Fe融合蛋白和缺乏附加糖基化位點的融合多肽的血清半壽期以進行比較。在示例性實施方案中，如本文所述在藥代動力學大鼠測定或藥代動力學猴測定中測定血清半壽期。在一些實施方案中，本公開內容提供制備相對于最初Fe融合蛋白具有延長的半壽期的修飾Fe融合蛋白的方法，所示方法通過a)在提供哺乳動物或哺乳動物樣糖基化的細胞培養物中表達已被修飾為引入至少ー 個附加N聯糖基化位點的核酸，和b)從細胞培養物中回收修飾Fe融合蛋白來進行。可利用任何適于從細胞培養物中獲取蛋白質的技術，將Fe融合蛋白作為未加工部分、部分純化部分或高度純化部分回收。在某些方面，在產生包含唾液酸的N聯糖部分的細胞系中表達修飾核酸。在某些方面，通過哺乳動物細胞系(包括但不限于CHO細胞系、NSO細胞系、COS細胞系或HEK236細胞系)，來表達修飾核酸。在其他方面，通過已工程改造為提供哺乳動物或哺乳動物樣糖基化的非哺乳動物細胞(包括但不限于基因工程真菌細胞、昆蟲細胞或植物細胞)，來表達修飾核酸。在某些方面，純化可包括以下步驟將修飾Fe融合蛋白暴露給A蛋白并回收與A蛋白結合的修飾Fe融合蛋白。在優選的實施方案中，將通過本公開內容的方法產生的Fe融合蛋白配制用于給予患者。在一些實施方案中，本公開內容提供包含按照本文所述任何方法制備的修飾核酸的細胞系。本專利技術的細胞系可包括哺乳動物細胞系(例如CHO細胞系、NSO細胞系、COS細胞系或HEK236細胞系)或已遺傳修飾成提供哺乳動物或哺乳動物樣糖基化的非哺乳動物細胞系(例如真菌細胞、昆蟲細胞或植物細胞)。在某些實施方案中，本公開內容提供以穩定性和/或血清半壽期増加為特征的糖變體(glycovariant) Fe融合蛋白以及用于產生半壽期增加的融合蛋白的方法。本專利技術的Fe融合蛋白包括但不限于包含免疫球蛋白Fe結構域和至少ー個異源多肽結構域的多肽。在免疫球蛋白Fe結構域之外修飾Fe融合蛋白，以引入至少ー個非內源N聯糖基化位點，其相對于缺乏引入的糖基化位點的融合蛋白的半壽期(例如，體外半壽期、體內半壽期或血清半壽期)，増加修飾融合蛋白的血清半壽期。在某些實施方案中，本專利技術的融合蛋白包含至少ー個非內源或引入的N聯糖基化位點，其相對于缺乏引入的糖基化位點的融合蛋白的血清半壽期，使所述融合物的血清半壽期增加至少10%、20%、30%、40%、50%、75%、100%、125%、150%、175%、200%、225%或250%或更多。在某些實施方案中，在相同的動物模型或物種中測定修飾Fe融合蛋白和缺乏附加糖基化位點的融合多肽的血清半壽期以進行比較。在示例性實施方案中，如本文所述在藥代動力學大鼠測定或藥代動力學猴測定中測定血清半壽期。可通過添加、缺失或取代一個或多個氨基酸殘基以引入ー個N聯糖基化位點來修飾本專利技術的Fe融合蛋白。在某些實施方案中，最初Fe融合蛋白的異源部分的姆50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、130、140或150個氨基酸中包含至少ー個N聯糖基化位點。在某些實施方案中，最初Fe融合蛋白的異源部分的每60、70、80、90、100、110、120或125個氨基酸中包含少于ー個N聯糖基化位點。在某些實施方案中，通過至少15、20、30、40、50、60、70、80、90或100個氨基酸將與N聯糖基化連接的修飾Fe融合蛋白的異源部分的各個氨基酸與任何其他被N聯糖基化修飾的氨基酸隔開。在某些實施方案中，在修飾Fe融合蛋白的N端、C端或者N端和C端二者的10、20、30、40或50個氨基酸之內不會出現附加的N聯糖基化位點。在優選的實施方案中，本專利技術的Fe融合蛋白包含至少兩個結構上不同的結構域，其通過表面暴露的(即可溶性環結構域)且未摻入a螺旋或P折疊中的氨本文檔來自技高網...

【技術保護點】

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】...

【專利技術屬性】
技術研發人員：J西拉，J克諾普夫，R庫馬，
申請(專利權)人：阿塞勒隆制藥公司，
類型：發明
國別省市：