本發明專利技術涉及用于產生突變蛋白的新文庫和源自人脂質運載蛋白2（Lcn2，hNGAL）的新突變蛋白以及相關蛋白，所述蛋白以可檢測的親和力結合給定靶標。本發明專利技術還涉及編碼這樣的突變蛋白的相應的核酸分子以及用于產生所述核酸分子的方法。本發明專利技術進一步涉及用于生產這樣的突變蛋白的方法。例如，這樣的突變蛋白可以用于結合天然生物分子的致病形式，例如阿爾茨海默氏病中的β淀粉樣肽，并使其耗盡，或者可以以與腫瘤新生血管相關的纖連蛋白額外結構域B為靶向。
【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】對給定靶標具有親和力的人脂質運載蛋白2 (Lcn2,hNGAL)的突變蛋白 本專利技術涉及用于產生突變蛋白的新文庫和源自人脂質運載蛋白2 (Lcn2, hNGAL)的新突變蛋白以及相關蛋白，所述蛋白以可檢測的親和力結合給定靶標。本專利技術還涉及編碼這樣的突變蛋白的相應的核酸分子以及用于產生所述核酸分子的方法。本專利技術進一步涉及用于生產這樣的突變蛋白的方法。此外，本專利技術涉及包含這樣的脂質運載蛋白突變蛋白的藥物組合物以及所述突變蛋白的多種用途。根據本專利技術的Lcn2突變蛋白顯示出在數個疾病領域作為治療和/或診斷試劑的潛力。例如，它們可以用于結合天然生物分子的致病形式(例如阿爾茨海默氏病中的P淀粉樣肽)并使其耗盡。在另一個實施例中，它們可以用于將各種標記或毒素特異靶向至疾病相關的細胞表面標記物，例如與腫瘤新生血管相關的纖連蛋白額外結構域B。由于可以根據本專利技術的產生的Lcn2突變蛋白的特殊益處，各種其它應用或實施例也是可以的。
技術介紹
阿爾茨海默氏病(AD)是老年人群中最為常見的癡呆形式。與AD相關的淀粉樣前體蛋白的缺陷性進程產生具有潛在神經毒性的包含40-42個殘基的0淀粉樣肽(A3)。 之后聚集成低聚物和長纖維，這在該疾病的過程中具有關鍵作用，從而聚集形成老年斑塊(Haass 和 Selkoe (2007) Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 8，101-112)。盡管 AD 越來越重要，但對于預防、治療或減緩所述癡呆的有效療法的需求仍未得到滿足。當前的抗淀粉樣方法的目標為(i)預防AP形成，(ii)阻斷其聚集，(iii)降低腦中可溶AP的水平，以及(iv)分解存在的淀粉樣斑塊。迄今為止，包括主動和被動免疫AD患者的免疫療法在此領域最有希望(Dodel等人(2003) Lancet Neurology 2，215-220;Lichtlen和 Mohajeri (2007) J. Neurochem. 104, 859-874 ;Brody和 Holtzmann (2008)Annu. Rev. Neurosci. 31, 175-193)。然而，由于6%的患者發生了腦膜腦炎，因此停止了主動免疫AD患者的近期臨床試驗。由于這些Fe介導的免疫功能的潛在不良反應，非Ig結合試劑例如Anticalin,提供了替代方案。與0淀粉樣蛋白具有特異性的親和體分子的識別是示出基因工程的非Ig結合蛋白的潛力的一個實例(Gr5nwall等人(2007)J. Biotechnol. 128，162-183 ；Hoyer 等人(2008) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105，5099-5104)。然而，親和體的細菌來源可能在人患者中造成免疫原性的問題。纖連蛋白(FN)在細胞粘附、遷移、增殖和分化中起重要作用。FN為大的模塊化的二聚體糖蛋白，其包含1、11和III型的多個結構域。FN的可選剪切變體，例如其額外結構域B (ED-B,在FNni7和FNm8結構域之間摻入)表現為組織特異的和發育階段依賴的行為(Zardi 等人(1987) EMBO J 6，2337-2342)。ED-B不存在于正常成人組織中，但在傷口愈合和腫瘤的血管形成期間例外。因此，含有ED-B的纖連蛋白在吸引新血管形成和經歷異常血管生成的多種不同腫瘤類型中大量表達。盡管ED-B在血管生成中的實際生物學功能尚不清楚，其在FN中的加入起到腫瘤發生的良好標記物的作用。通常，區分惡性組織和健康器官是有利的治療策略，原因在于，使藥物直接選擇性靶向到腫瘤組織使得藥物局部濃度提高。為了特異性檢測和靶向ED-B，使用噬菌體展示抗體技術提供了重組抗體片段。分離的抗體片段中的一種為L19單鏈Fv (Carnemolla等人(1996) Int. J. Cancer 68,397-405 ;Ebbinghaus 等人(2004) Curr. Pharm. Des. 10，1537-1549)。目前通過 L19組合有效的細胞毒性藥劑來解決ED-B顯示了癌癥治療和診斷的前景(Schliemann和Neri(2007) Biochim. Biophys. Acta 1776, 175-192 ；Kaspar 等人(2006) Int. J. Cancer118， 1331-1339)。然而，L19 scFv片段易于寡聚化。由于在治療阿爾茨海默氏病和腫瘤的診斷或治療中存在的上述問題，本專利技術的目的是提供可以用于治療和腫瘤的診斷或治療中的替代方法和化合物。
技術實現思路
本專利技術人發現，源自脂質運載蛋白2的蛋白的特定突變蛋白由于其穩定性更好并且尺寸更小，因此是具有吸引力的化合物。本專利技術人鑒定了特定組的脂質運載蛋白2突變蛋白，其在特定位點具有突變，顯示具有例如與ED-B的高親和力和特異性。這種Lcn2突變蛋白以高靈敏性特異性地識別人細胞上的含ED-B的纖連蛋白，因而顯示了作為用于診斷和治療腫瘤疾病的治療試劑的前景。本專利技術人還得以鑒定了與AP肽具有高親和力和特異性的特定Lcn2突變蛋白。這種Lcn2突變蛋白還可以抑制AP聚集，并因而顯示了在進一步改進和修飾后可以作為治療AD的治療試劑的前景。此外，本專利技術還描述了基于人Lcn2支架的新隨機文庫，所述文庫允許有效產生通常與給定靶標具有高親和力和特異性的突變蛋白，例如本專利技術的突變蛋白。這種文庫或其部分的實例示于圖I和2。在一個方面，至少在編碼hLcn2線性多肽序列的序列位置36、40、41、49、52、68、70、72、73、77、79、81、96、100、103、106、125、127、132 和 134 中任一個的 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個核苷酸三聯體處，通過此位置處以核苷酸三聯體組實現的替換，進行隨機突變。核苷酸三聯體組可以是指、但不限于(a)少于由核苷酸NNN編碼的64個可能的三聯體(如果N = A、T、G、C，則表示4x4x4=64個可能的三聯體)，(b)少于由核苷酸NNK或NNS編碼的32個可能的三聯體，(c)少于編碼全部20個天然蛋白氨基酸的必需三聯體。在另一個實施方案中，在突變期間，編碼半胱氨酸的核苷酸三聯體不用于替換。這意味著突變不帶來在原始未經突變的序列中不包含的攜帶新半胱氨酸的突變蛋白。因而，在這一方面規定了那些核苷酸三聯體將被引入到如本段落所規定的待突變位置(同樣參見實施例I和圖2)。因而，在第一方面，本專利技術涉及一種產生源自人脂質運載蛋白2 (Lcn2 ;也稱為人中性粒細胞明膠酶相關的脂質運載蛋白即hNGAL或稱為siderocalin)的突變蛋白的方法。以此方法獲得的突變蛋白能夠以可檢測的親和力結合非天然靶標。該方法包括使編碼人脂質運載蛋白2 (Lcn2，hNGAL)的核酸分子發生突變，所述突變發生在對應于人脂質運載蛋白2線性多肽序列的序列位置96、100和106的序列位置中的至少一個處，從而得到一種或多種突變蛋白核酸分子。根據上文，術語“人脂質運載蛋白2”或“人中性粒細胞明膠酶相關的脂質運載蛋白(hNGAL) ”包括來自其它物種的已被鑒定或尚未分離的結構同源物，所述結構同源物具有大于約60%的氨基酸序列同源性或序列同本文檔來自技高網...
【技術保護點】
【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】...
【專利技術屬性】
技術研發人員：A·斯克拉，M·格鮑爾，D·欣茲，S·勞特，G·馬欽內爾，M·胡爾斯邁爾，
申請(專利權)人：皮里斯股份公司，
類型：發明
國別省市：
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