人工皮膚制造技術

本發明專利技術涉及一種人工皮膚的制造方法，其特征在于，在包含來源于人表皮的角質形成細胞和來源于人真皮的成纖維細胞的形成人工皮膚的培養基中添加基質金屬蛋白酶抑制劑和乙酰肝素酶抑制劑，對該形成人工皮膚的培養基中的細胞進行培養，從而形成人工皮膚。

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】
本專利技術涉及通過使用基質金屬蛋白酶抑制劑和乙酰肝素酶抑制劑的人工皮膚的新的制造方法、以及通過該方法制造的新的人工皮膚。
技術介紹
覆蓋以人類為代表的各種動物的整個身體的皮膚處于由日光、干燥、氧化、環境造成的壓力、精神壓力等外界因素以及年齡增長所引起的皺紋的形成、硬化、斑、暗沉、彈性的降低等變化中。在天然皮膚中，大地分類由表皮和真皮這兩層構成，在表皮與真皮之間存在被稱為表皮基底膜的薄且纖細的膜。表皮基底膜為約O. ιμπι左右的非常薄的結構體，片狀地存在于表皮與真皮的接合部。表皮基底膜由作為基本結構的致密層(lamina densa)和透明層(lamina densa)、以及角質形成細胞的半橋粒、錨絲(anchoring filament)、錨纖維等構成，特別是該基本結構由IV型膠原、各種層粘連蛋白(Iaminin)、和蛋白聚糖等構成。結合著表皮基底細胞與基本結構、特別是致密層的錨絲的主要成分為層粘連蛋白5，基本結構與真皮的膠原纖維通過以VII型膠原為主成分的錨纖維被連結。此外，錨絲與錨纖維可以彼此結合，它們形成被稱為錨復合體的復合體。通過這樣的結構，生物體的最外層存在的皮膚保持抵御來自外界的力學壓力的強度(化妝品事典，日本化妝品技術者會編，P405-406)。然而，在由于某種原因而天生的皮膚(即，天然皮膚)受到損傷的情況下，作為其代替物的人工皮膚的需求提高。此外，作為用于測試藥品、化妝品對皮膚的作用、藥物的實驗材料，人工皮膚的開發也是極其重要的，在任一用途中都強烈期望盡可能模仿天然皮膚的結構的人工皮膚。作為以往的人工皮膚的制造方法，已知在包含人成纖維細胞的收縮I型膠原凝膠 上培養正常人表皮角質形成細胞而形成表皮層的方法。然而，在該方法中，在模仿真皮的膠原凝膠與模仿表皮的表皮層之間不能充分地形成基底膜，因此在使用這樣的人工皮膚的情況下，通過施與基質金屬蛋白酶抑制劑、或基質金屬蛋白酶抑制劑和基質蛋白質產生增強劑這兩者，從而促進皮膚基底膜結構的再形成(日本特開2001-269398號公報)。此外，已知抑制絲氨酸蛋白酶的物質以及提高作為表皮基底膜成分的主要構成成分的IV型、VII型膠原或層粘連蛋白5的產生量的物質會促進由基質蛋白酶抑制劑產生的促進基底膜形成的效果(日本特開2004-75661號公報)。然而，在通過這樣的現有技術制造的人工皮膚中，表皮基底膜與真皮的高級結構的形成仍然不成熟，不能說充分地實現了表皮基底膜與真皮間的通訊。此外，已知抑制乙酰肝素酶活性的化合物在皮膚的皺紋形成過程中改善生物體內的基底膜功能，由此抑制皺紋的形成(W0 2009/123215號)，但是關于通過使該化合物與基質金屬蛋白酶抑制劑進行組合，來促進人工皮膚的表皮基底膜和真皮的再形成，并不知道。現有技術文獻專利文獻專利文獻I :日本特開2001-269398號公報專利文獻2 :日本特開2004-75661號公報專利文獻3 W02009/123215 號
技術實現思路
專利技術要解決的課題本專利技術的目的是提供充分地實現了表皮基底膜與真皮間的通訊，無限地接近天然皮膚的結構的人工皮膚。用于解決課題的方法此次，本專利技術人在包含來源于人表皮的角質形成細胞和來源于人真皮的成纖維細 胞的形成人工皮膚的培養基中添加基質金屬蛋白酶抑制劑和乙酰肝素酶抑制劑，對該培養基中的細胞進行培養，從而形成了人工皮膚，結果成功地獲得表皮基底膜和真皮的高級結構極其近似于天然皮膚的人工皮膚。因此，本申請包含以下的專利技術[I] 一種人工皮膚的制造方法，其包括在包含來源于人表皮的角質形成細胞和來源于人真皮的成纖維細胞的形成人工皮膚的培養基中添加基質金屬蛋白酶抑制劑和乙酰肝素酶抑制劑，對該形成人工皮膚的培養基中的細胞進行培養，從而形成人工皮膚。[2] 一種人工皮膚，其特征在于，包含含有連續的致密層和從該致密層產生的錨纖維的表皮基底膜、和含有膠原纖維的真皮，通過所述表皮基底膜中存在的從連續的致密層產生的錨纖維與真皮中存在的膠原纖維進行結合，從而表皮基底膜與真皮被牢固地粘接。[3]根據上述[2]所述的人工皮膚，所述真皮還包含原纖維沉積物(fibripositor)。[4]根據上述[2]或[3]所述的人工皮膚，其特征在于，在所述真皮中形成有彈性蛋白纖維。[5]根據上述[2] [4]的任一項所述的人工皮膚，其特征在于，是通過上述[I]所述的方法制造的。[6] 一種人工皮膚，其特征在于，是在包含基質金屬蛋白酶抑制劑和乙酰肝素酶抑制劑的培養基中形成的人工細胞，該人工細胞包含含有連續的致密層和從該致密層產生的錨纖維的表皮基底膜、和含有膠原纖維的真皮，通過所述表皮基底膜中存在的從連續的致密層產生的錨纖維與真皮中存在的膠原纖維進行結合，從而表皮基底膜與真皮被牢固地粘接。專利技術的效果令人驚訝的是，在通過本專利技術的方法獲得的人工皮膚的表皮基底膜內，確認了在以往的人工皮膚中觀察不到的連續而均勻的致密層以及與該致密層結合的錨纖維的形成。此外，在該人工皮膚的真皮內，觀察到迄今為止僅在天然皮膚中報告的原纖維沉積物(fibripositor),此外確認了在以往的方法中再構建極其困難的彈性蛋白纖維的形成。這些表皮基底膜和真皮的高級結構與天然皮膚的高級結構極其近似。附圖說明圖I為顯示對照組、在培養液中僅添加基質金屬蛋白酶(MMP)抑制劑而培養的皮膚模型(A組)、在培養液中僅添加乙酰肝素酶抑制劑而培養的皮膚模型(B組)、在培養液中添加MMP抑制劑和乙酰肝素酶抑制劑這兩者而培養的皮膚模型(C組)的基底膜的結構的照片。圖2為顯示對照組、在培養液中僅添加基質金屬蛋白酶(MMP)抑制劑而培養的皮膚模型(A組)、在培養液中僅添加乙酰肝素酶抑制劑而培養的皮膚模型(B組)、在培養液中添加MMP抑制劑和乙酰肝素酶抑制劑這兩者而培養的皮膚模型(C組)的基底膜正下方的真皮中存在的成纖維細胞的照片。對照組、A組、B組為通常的成纖維細胞，與此相對，C組顯示包含原纖維沉積物的成纖維細胞。圖3為顯示在培養液中添加MMP抑制劑和乙酰肝素酶抑制劑這兩者而培養的皮膚模型(C組)的真皮內形成的彈性蛋白纖維的照片。 具體實施例方式基質金屬蛋白酶(MMP)抑制劑作為在本專利技術中使用的基質金屬蛋白酶抑制劑，只要是對基質金屬蛋白酶具有抑制活性的物質即可，沒有特別的限制。作為基質金屬蛋白酶，可舉出例如明膠酶、膠原酶、基質溶素(stromelysin)、間質溶素(matrilysin)等。因此,基質金屬蛋白酶抑制劑可以選擇作為抑制例如明膠酶、膠原酶、基質溶素、間質溶素等的物質。作為基質金屬蛋白酶抑制劑的具體例，可舉出CGS27023A物質(N-羥基-2-[[(4-甲氧基苯基)磺酰基]3-吡啶甲基)氨基]-3-甲基丁酰胺鹽酸鹽)(J. Med.Chem. 1997，Vol. 40，p. 2525-2532)、MMP-抑制劑(p-NH2-Bz-Gly-Pro-D-Leu-Ala_NHOH) (FN-437) (BBRC, 1994，Vol. 199，p. 1442-1446)等。基質金屬蛋白酶抑制劑優選為CGS27023A 物質。乙酰肝素酶抑制劑作為在本專利技術中使用的乙酰肝素酶抑制劑，只要是對乙酰肝素酶具有抑制活性的物質即可，沒有特別的限制。乙酰肝素酶為存在于各種細胞中，將本文檔來自技高網...

【技術保護點】

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】2010.03.04 JP 048159/20101.一種人工皮膚的制造方法，其包括在包含來源于人表皮的角質形成細胞和來源于人真皮的成纖維細胞的形成人工皮膚的培養基中添加基質金屬蛋白酶抑制劑和乙酰肝素酶抑制劑，對該形成人工皮膚的培養基中的細胞進行培養，從而形成人工皮膚。2.—種人工皮膚，其特征在于，包含含有連續的致密層和從該致密層產生的錨纖...

【專利技術屬性】
技術研發人員：入山俊介，海鹽健一，常長誠，豬股慎二，安達榮治郎，
申請(專利權)人：株式會社資生堂，
類型：發明
國別省市：