本發明專利技術公開了二苯乙烯苷防治骨質疏松的應用，TSG對成骨細胞前體細胞無毒性作用，不影響細胞增殖；對過氧化氫（H2O2）造成的成骨細胞前體細胞（MC3T3-E1）的凋亡具有保護作用；并且在其分化過程中改善H2O2誘導的氧化應激狀態；對H2O2造成的MC3T3-E1成骨分化抑制具有保護作用；可以抑制骨吸收因子的表達，從而通過改善成骨細胞凋亡和分化抑制及間接抑制破骨細胞活化來對骨質疏松起保護作用。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于骨質疏松的防治
，涉及二苯乙烯苷防治骨質疏松的應用。
技術介紹
骨質疏松癥(osteoporosis，0P)是退行性、全身性、代謝性骨骼疾病，是由多種病因導致的骨組織骨量丟失、結構改變和生物力學性能減退，容易發生骨折，嚴重威脅老年人的身體健康。氧化應激(oxidative stress)是機體內高活性物質如ROS (Reactive oxygenspecies)產生過多，超出了機體的清除能力，導致氧化和抗氧化失衡的一種狀態。生理范圍內的ROS在調節人體正常的功能如細胞凋亡、基因表達、信號轉導等方面起著重要的作用。然而，高濃度的ROS可以導致核酸、蛋白質、脂質產生氧化反應，損害細胞的結構和功能，弓丨·起疾病的發生。近年來，研究發現氧化應激在骨質疏松發生發展中起重要作用。過量氧自由基(ROS)的產生可以抑制骨髓基質干細胞(MSCs)成骨分化，造成MSCs和成骨細胞(OB)凋亡，促進破骨細胞(OC)活化和功能增強，導致骨吸收和骨形成失衡，引起骨微結構改變和骨量降低。何首烏為寥科植物何首烏的干燥塊根，其主要功效有補肝腎，益精血，烏須發，強筋骨。二苯乙烯苷(TSG)是何首烏中主要水溶性活性成分，具有多項生理功能抗氧化清除自由基；抗腫瘤；降低膽固醇；抑制動脈粥樣狀硬化；防治老年癡呆；提高記憶力等。
技術實現思路
本專利技術解決的問題在于提供二苯乙烯苷(TSG)防治骨質疏松的應用，TSG可應用于防治骨質疏松的藥物的制備。本專利技術是通過以下技術方案來實現二苯乙烯苷防治骨質疏松的應用。二苯乙烯苷在防治骨質疏松藥物的制備中的應用。二苯乙烯苷在改善成骨細胞前體細胞氧化應激狀態藥物的制備中的應用。二苯乙烯苷在成骨細胞前體細胞凋亡保護藥物的制備中的應用。含二苯乙烯苷的何首烏提取物在防治骨質疏松藥物的制備中的應用。與現有技術相比，本專利技術具有以下有益的技術效果二苯乙烯苷對成骨細胞前體細胞(MC3T3-E1)無毒性作用、對過氧化氫(H2O2)造成的MC3T3-E1的凋亡具有保護作用；并且可以改善H2O2造成的氧化應激狀態；對H2O2造成的MC3T3-E1分化抑制具有保護作用；可以抑制骨吸收因子的表達。MC3T3-E1細胞是研究成骨細胞生長、分化的較常用的細胞模型，鑒于二苯乙烯苷對MC3T3-E1的作用，其對成骨細胞具有保護作用，促進骨形成，并通過抑制骨吸收因子來抑制破骨細胞的活化，來降低骨吸收，最終起到防治骨質疏松的作用。二苯乙烯苷為我國傳統中藥何首烏的有效提取物之一，為純天然提取物，用藥較安全，毒副作用小。因此，二苯乙烯苷可應用于骨質疏松的防治，尤其是在防治骨質疏松藥物的制備中的應用。附圖說明圖I為過氧化氫有效濃度的篩選。觀察不同濃度H2O2作用不同時間后，細胞的增殖情況。圖2-1為不同濃度TSG對細胞增殖作用的影響，圖2-2為TSG對H2O2造成細胞凋亡的保護作用，圖2-3為TSG保護作用的顯微鏡下觀察情況，圖2-4為細胞凋亡的Hochest33258 染色結果。圖3-1為TSG可以改善細胞氧化應激ROS水平的檢測結果，圖3_2為TSG可以改·善細胞氧化應激MDA水平的檢測結果。圖4-1為TSG在H2O2作用后，對細胞堿性磷酸酶(ALP)活性的作用，圖4_2為TSG在H2O2作用后，對細胞基質鈣鹽沉積的作用，圖4-3為TSG對三種細胞成骨分化基因表達水平的影響。圖5為TSG在H2O2作用后對兩種骨吸收因子表達的影響。具體實施例方式下面結合具體的實施方案對本專利技術做進一步的詳細說明，所述是對本專利技術的解釋而不是限定。MC3T3-E1為成骨細胞前體細胞系，可以向成骨細胞進行分化，是研究成骨細胞生長、分化的較常用的細胞模型，H2O2處理也是較常用的體外氧化應激模型，出于觀察二苯乙烯苷對成骨細胞凋亡和分化的影響，及其抗氧化損傷的作用，所以選擇MC3T3-E1作為細胞模型，H2O2處理為體外氧化應激模型。I、體外氧化應激模型的建立將MC3T3-E1細胞以2X IO3接種到96孔板上，待細胞長滿后，棄掉培養基，加含100,200,300,400 u M/L H2O2的無血清的培養基至孔板中，分別作用2h，6h，12h, 24h,每組6個復孔。至觀察點后，利用MTT比色法來篩選合適的過氧化氫作用濃度和時間，加20 Ul的5mg/ml的MTT溶液，孵育4小時后，加DMS0，震蕩5分鐘，在酶標儀上492nm波長讀數。結果如圖I所示，橫坐標為不同濃度的H2O2作用時間，縱坐標為吸光度OD值，由圖可見，伴隨H2O2的濃度和作用時間的延長，MC3T3-E1細胞活性逐漸降低。具體選擇300 u MH2O2作用24小時的處理作為體外氧化應激模型，在該處理下細胞存活率在50%左右。2、TSG對氧化應激導致MC3T3-E1凋亡的保護作用2. I單純TSG對細胞的毒性作用將MC3T3-E1細胞以2X IO3接種到96孔板上，待細胞長滿后，棄掉培養基，加含不同濃度0、0. UUlOuM/L TSG的無血清培養基至孔板中，培養24h和72h，觀察TSG對細胞增殖作用的影響。在觀察點，利用MTT法對細胞活性進行檢測。 結果如圖2-1所示，橫坐標為不同濃度的TSG作用時間，該圖的縱坐標為吸光度OD值，由圖可見，不同濃度的TSG在觀察時間內，對細胞的增殖并無明顯影響。2. 2TSG對氧化應激導致MC3T3-E1凋亡的保護作用分組情況①空白對照組；②單純H2O2處理組0. I ii M/L TSG+H202;④I ii M/LTSG+H202;⑤IOiI M/L TSG+H202;⑥陽性對照組ImM N-乙酰半胱氨酸(NAC) +H2O2處理組。在TSG預處理組，分別加入0、0. UUlOuM/L TSG無血清培養基至接種MC3T3-E1細胞的96孔板中，作用24h，陽性對照組加入ImM NAC，然后，加入H2O2 (300 iiM)，作用24h后，利用MTT法進行細胞活性檢測。結果如圖2-2所示，橫坐標為各組的作用方式，縱坐標為 吸光度OD值，以各組的OD值同空白對照組的OD值進行比較的百分數來表述。由圖可見，單純H2O2作用后，細胞活性降低，經不同濃度TSG作用后細胞活性增加，同單純H2O2作用組相比，具有統計學差異。圖中的星號表示同單純H2O2作用組相比，*P < 0. 05，林P < 0. 01。這表明用TSG處理后能夠保護氧化應激導致MC3T3-E1的凋亡。2. 3顯微鏡觀察TSG對氧化應激導致MC3T3-E1凋亡保護的細胞形態將MC3T3-E1細胞以4X IO5接種到6孔板上，待細胞長滿后，棄掉培養基，加I和10 U M/L TSG的無血清培養基至孔板中，預處理24h，空白組加無血清培養基，然后，加入300 ii M的H2O2至孔板中，24h后，倒置顯微鏡下觀察細胞形態。結果如圖2-3所示，圖①為正常對照組，圖②為單純H2O2作用組，圖③④分別為I和IOii M/L TSG作用組。可見，單純H2O2處理后，有較多的細胞死亡，細胞形態發生改變，經TSG處理后，狀態有改善，死亡細胞比率下降。2. 4細胞凋亡的Hochest33258染色將MC3T3-E1細胞以4X IO5接種到6孔板上，待細胞長滿后，棄掉培養基，加I和10 U M/L 本文檔來自技高網...
【技術保護點】
二苯乙烯苷防治骨質疏松的應用。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：張金康，劉建，楊柳，孟國林，袁志，羅卓荊，
申請(專利權)人：中國人民解放軍第四軍醫大學，
類型：發明
國別省市：
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