區分FECV和FIPV的工具和方法技術

本發明專利技術提供了用于區分FECV和FIPV的方法和工具，及用于確定樣品中是否存在FIPV的方法和工具。本發明專利技術進一步提供了用于檢測編碼纖突蛋白的FIPV特異核酸序列的引物和探針，用于檢測FIPV的抗體，及用于激發針對貓冠狀病毒，優選FIPV的免疫應答的免疫原性組合物及其應用。

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】
本專利技術涉及獸醫診斷領域，更具體地本專利技術涉及貓冠狀病毒及其鑒定的領域。
技術介紹
貓冠狀病毒(FCoV)是家養和非家養貓科動物(包括但并不限制于貓、獅子、老虎、豹、美洲虎、猞猁、獰貓、獵豹、美洲獅和藪貓(serval))中常見的病原體。在家養多只貓的環境中可達90%的FCoV血清反應陽性。FCoV與犬冠狀病毒(CCoV)和豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)密切相關。FCoV存在兩種血清型(I型和II型)，其中I血清型是主要的、占FCoV感染的80 95%。II型FCoV可能由在被I血清型FCoV和CCoV雙重感染的動物中的RNA重組造成，其中CCoV的纖突基因(spike gene)或其部分并入FCoV的基因組中(這顯然是很少發生的事件)。貓腸道冠狀病毒(FECV)在I血清型和II血清型的FCoV中均為最常見 的病原體。FECV主要限于腸道內，經由口-糞途徑傳播，且是高傳染性的。FECV感染通常不明顯地發生；但有時FECV引起諸如輕微腸炎的癥狀(Haijema等，2007)。在二十世紀七十年代，報道了一種在貓中罕見但嚴重的疾病貓傳染性腹膜炎(FIP)，是由被稱為貓傳染性腹膜炎病毒(FIPV)的貓冠狀病毒引起的。與FECV相反，FIPV是高毒性的。FIPV感染可為肉芽腫(干的)或流出型(濕的)，且FIPV感染是進行性的且通常致命的疾病。FIP的癥狀包括幼貓未能存活、跛行、波動發燒、食欲不振和體重減輕，最終會導致死亡(Pedersen 2009)。如高丙種球蛋白血癥及淋巴和外周T細胞缺失所顯示的自適應免疫系統的顯著失調伴隨FIP的發展(Haijema等，2007)。然而FECV限于腸道內，FIPV能夠感染單核細胞和巨噬細胞，且能夠在單核細胞和巨噬細胞中復制，從而引起使多器官被感染的系統性疾病。存在兩種關于FIPV起源的流行理論。根據“突變假說”，FIPV通過被感染的貓科動物中的新生突變而起源于FECV，產生高毒性的FIP病毒。雖然還未鑒定出產生FIPV的突變，但已提出該突變存在于編碼未知功能的非結構基因3c、7a或7b中(見圖I) (Vennema等，1998，Poland 等，1996，Kennedy 等，2001，Pedersen 2009)。因此認為在 3c、7a 或 7b 基因中的突變或在這些基因中的突變重組改變了病毒的生物學特性，允許腸道冠狀病毒感染單核細胞和巨噬細胞，從而將感染傳播至多個器官且引起FIP (Pedersen 2009) :FECV至FIPV的轉變。但突變假說還沒未被正式證明。根據另一種理論，兩種不同類型的FECV (毒性和無毒性類型)在自然群體中傳播，且只有被毒性類型感染的貓科動物才會發生FIP (Brown等，2009)。Brown等(2009)從患有FIP和被FECV感染但無癥狀(健康)的貓中分離了病毒序列。使用系統發育分析，他們發現在患病貓和健康貓中存在不同的病毒序列。Dye和Siddell (2007)比對了從患有FIP的貓的空腸和肝臟中分離的貓冠狀病毒的病毒序列。根據突變理論，FECV限制于腸道內，而能夠感染單核細胞和巨噬細胞的FIPV存在于肝臟中。迄今為止，Dye和Siddell發現100%的核苷酸一致性，因此對突變假說提出質疑，因為根據該突變假說肝臟的冠狀病毒是突變的空腸冠狀病毒。他們提出在患有FIP的貓的肝臟和空腸中存在相同的毒性貓冠狀病毒株。之前，本專利技術人已在組織培養適應性的II血清型貓冠狀病毒FECV79-1683和FIPV79-1146的纖突蛋白中鑒定了很多不同(Rottier等，2005)。FIPV 79-1146在纖突蛋白的C末端結構域(S2結構域)中包含幾個突變。但是FECV79-1683和FIPV79-1146不是典型的貓冠狀病毒，因此不是大部分貓被感染的I血清型FECV和FIPV的代表(Pedersen2009)。首先，II血清型貓冠狀病毒源自犬和貓冠狀病毒的RNA重組，且II血清型貓冠狀病毒包含犬冠狀病毒的纖突蛋白。貓和犬冠狀病毒的纖突蛋白僅具有約45%的氨基酸序列一致性(Motokawa等，1996)。其次，FECV79-1683和FIPV79-1146是對非巨噬細胞的細胞系的組織培養適應性的。因為FIPV在體內感染單核細胞和巨噬細胞，這些實驗室菌株的嗜性(tropism)與典型的貓冠狀病毒不同。第三，與感染單核細胞和巨噬細胞的I血清型FIPV不同，FIPV79-1146通過感染的所有常見途徑而具有異常毒性(Pedersen 2009)。第四，如Pedersen在他最近的綜述中所全面討論的，FECV79-1683不能具有真正FECV的資格(Pedersen 2009)。值得注意的是，FECV79-1683缺少存在于FECV的非組織培養適應性株系中的7b基因的大部分，且FECV79-1683在它的3c基因中具有有害突變，這表明·FECV79-1683 可能源自 FIPV。通常通過血液中抗體的存在來證明受到貓冠狀病毒感染。但沒有對FIPV感染的有效治療方法或疫苗。在干或肉芽腫型FIP的情況下，患FIP的貓在幾天或幾個星期(在流出型FIP的情況下)內死亡，或在幾個月內(在干式FIP或濕式FIP的情況下)死亡。在許多免疫研究中還未令人信服地證明由FIPV株的溫度敏感突變株組成的市場上可買到的疫苗具有保護療效(McArdle等，1995 ；Fehr等，1997)。進一步地，到目前為止沒有診斷試驗來區分FECV和FIPV。又一復雜因素是FIP的臨床圖片是高度可變的，因此不能明確的確定疾病。診斷經常是基于既往癥、臨床和非特異性實驗室參數作出的推測性診斷。因為沒有針對FIPV的特異性診斷試驗，因此還經常不能區分FIP和具有部分相同癥狀的其它疾病。由于FIP的愈來愈嚴重和衰竭性過程，因此極需要針對FIPV的診斷試驗和抗FIPV的疫苗。
技術實現思路
本專利技術的目的是提供區分FIPV和FECV的工具和方法。本專利技術人發現FIPV在纖突蛋白的氨基酸第1049位處具有相對于FECV的特異性改變，如圖2B所示。因此，本專利技術提供了一種鑒定貓傳染性腹膜炎病毒(FIPV)的方法，包括確定貓冠狀病毒纖突蛋白在對應于氨基酸第1049位(如圖2B所示)的位置處的氨基酸本體；且如果該確定的氨基酸本體不是甲硫氨酸，則鑒定該貓冠狀病毒為FIPV。根據本專利技術的該方法，如果確定的該氨基酸本體是甲硫氨酸，則鑒定為FECV。鑒定FIPV或FECV是指毒性(FIPV)或無毒性(FECV)型貓冠狀病毒的鑒定。通過確定所述貓冠狀病毒的氨基酸本體(identity)和/或核酸序列來進行鑒定。貓冠狀病毒的核酸序列包括核苷酸鏈，優選為(c) DNA或RNA，該核苷酸鏈為貓冠狀病毒的一部分，或直接或通過處理例如使用逆轉錄PCR和/或擴增后從貓冠狀病毒獲得。貓冠狀病毒的纖突蛋白是包括胞外結構域的貓冠狀病毒膜蛋白。纖突蛋白是冠狀病毒四個標準結構蛋白中的一個，且負責在感染過程中的病毒結合并進入細胞。將來自患有經病理學確定的FIP的貓的病灶(lesion)的FIPV與來自無癥狀的貓的FECV進行基因比對。FIP的典型病灶是在內臟器官，主要是在脾臟、肝臟、肺、腎臟或腸系膜淋巴結中存在的(膿)肉芽腫性病灶。由于RNA本文檔來自技高網...

【技術保護點】

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】...

【專利技術屬性】
技術研發人員：彼得魯斯·約瑟夫斯·瑪麗·羅提爾，張惠雯，赫爾曼·F·艾格伯林克，
申請(專利權)人：烏得勒支大學控股有限公司，
類型：發明
國別省市：