一種從人皮膚細胞直接誘導(dǎo)的神經(jīng)元細胞及其制備方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，涉及一種從人皮膚細胞直接誘導(dǎo)的神經(jīng)元細胞及其制備方法；本發(fā)明專利技術(shù)方法通過將包含重編程轉(zhuǎn)錄因子Sox2、Ascl1和Myt1l的cDNA導(dǎo)入離體成人皮膚細胞后，篩選表達人神經(jīng)元細胞標記物的細胞克隆，直接制得能穩(wěn)定傳代的誘導(dǎo)型人神經(jīng)元細胞。所述的神經(jīng)元細胞具有以下特征：（1）在體外表達人神經(jīng)元細胞特異性標志蛋白；（2）在體內(nèi)可存活并發(fā)揮功能。本發(fā)明專利技術(shù)獲得具有功能的人神經(jīng)元細胞不需經(jīng)過多能干細胞的過程，技術(shù)更簡單有效；無異源飼養(yǎng)層參與，臨床應(yīng)用前景更好；采用的轉(zhuǎn)錄因子未見有致瘤相關(guān)報道，生物安全性更高。

【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，涉及神經(jīng)元細胞誘導(dǎo)的方法，具體涉及一種從人皮膚細胞直接誘導(dǎo)神經(jīng)元細胞的方法。
技術(shù)介紹
神經(jīng)系統(tǒng)疾病如腦損傷、脊髓損傷、中風、帕金森病、神經(jīng)元性肌萎縮側(cè)索硬化癥、阿爾茨海默病等社會危害大、治療難度高，長期以來是醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的難題。已有研究表明，利用人神經(jīng)元細胞研究神經(jīng)損傷的機理，篩選干預(yù)神經(jīng)功能的新藥，并用于移植修復(fù)受損神經(jīng)功能是有效且具應(yīng)用前景的方法；但功能神經(jīng)細胞的來源途徑有限，以往常用胚胎干細胞(embryonic stem cells, ES 細胞)分化獲得人神經(jīng)細胞(Wichterle H，Lieberam I,Porter JA, et al. Directed differentiation of embryonic stem cells into motorneurons. Cell. 2002; 110(3) : 385-397)，而ES細胞的使用又一直受到倫理學(xué)的爭議，因此，獲得大量可用于基礎(chǔ)研究及臨床應(yīng)用的功能性神經(jīng)元細胞具有重要的科學(xué)和社會意義。2006 年，Yamanaka 等通過四種轉(zhuǎn)錄因子(Oct-3/4, Sox2, c_Myc, KLF4)介導(dǎo)，將小鼠成纖維細胞轉(zhuǎn)變?yōu)樵谛螒B(tài)、增殖和畸胎瘤形成能力等方面與ES細胞相似的“誘導(dǎo)型多能干細胞” (induced pluripotent stem cell, iPS 細胞)(Takahashi K，Yamanaka S.Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblastcultures by defined factors. Cell. 2006; 126(4): 663-676);所述的 iPS 細胞不涉及倫理爭議，可分化為神經(jīng)細胞(Dimos JT, Rodolfa KT, Eggan K，et al. Inducedpluripotent stem cells generated from patients with ALS can be differentiatedinto motor neurons. Science. 2008; 321 (5893): 1218-1221),其開創(chuàng)的外源轉(zhuǎn)錄因子誘導(dǎo)細胞重編程的方式成為近年來干細胞研究的重大突破。但是，制備所述iPS細胞引入了 c-Myc和KLF4兩個致癌因子，其分化潛能又決定了有產(chǎn)生畸胎瘤的危險，這些缺陷嚴重影響了 iPS細胞的推廣和應(yīng)用；因此，利用外源轉(zhuǎn)錄因子誘導(dǎo)的方法，從皮膚細胞獲得安全、具功能的神經(jīng)細胞，是一種較為理想的策略。2008年，哈佛大學(xué)Douglas Melton教授領(lǐng)導(dǎo)的研究團隊使用一套以三個轉(zhuǎn)錄因子為主的誘導(dǎo)體系將胰島外分泌細胞直接轉(zhuǎn)化為胰島內(nèi)分泌P細胞(Zhou Q, BrownJ, Kanarek A, et al. In vivo reprogramming of adult pancreatic exocrine cellsto ^ -cells. Nature, 2008, 455: 627-632)。2010 年 I 月，美國斯坦福大學(xué)醫(yī)學(xué)院的Marius Wernig等在《Nature》雜志上報道,誘導(dǎo)細胞重編程可繞過iPS這一步驟,直接在體外將小鼠的胚胎和成體皮膚細胞轉(zhuǎn)變?yōu)檎T導(dǎo)型神經(jīng)元細胞(Vierbuchen T, OstermeierA, Pang ZP, et al. Direct conversion of fibroblasts to functional neuronsby defined factors. Nature. 2010; 463 (7284) : 1035-41 )。2010 年 8 月，美國和日本的研究人員在《Cell》雜志網(wǎng)絡(luò)版上報道，他們通過在小鼠成纖維原細胞中植入特定基因，成功培育出可自發(fā)收縮的心肌細胞(Ieda M, Fu JD, Delgado-Olguin P，et al.Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by definedfactors. Cell. 142:375-386)。2011年3月，美國的科研人員報道，使用制備iPS細胞的4個轉(zhuǎn)錄因子也可直接將小鼠皮膚細胞轉(zhuǎn)變成心臟細胞(Efe JA, Hilcove S，KimJH, et al. Conversion of mouse fibroblasts into cardiomyocytes using a directreprogramming strategy. Nature Cell Biology. 2011; 13 (3) : 215-223)。上述的動物研究成果表明，利用外源轉(zhuǎn)錄因子誘導(dǎo)的方法，有望不需經(jīng)過多能干細胞(iPS細胞)這一步驟，直接從皮膚細胞獲得誘導(dǎo)型人神經(jīng)元細胞，且此種細胞類型轉(zhuǎn)換方法不使用腫瘤相關(guān)因子，所獲細胞不會在體內(nèi)形成畸胎瘤，具有很好的安全性。但是，上述的技術(shù)方法尚存以下缺陷1)到目前為止，使用誘導(dǎo)小鼠的轉(zhuǎn)錄因子組合來誘導(dǎo)人的皮膚細胞，不能得到人的誘導(dǎo)型神經(jīng)元細胞；2)在動物實驗中，可通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)，將標識細胞類型轉(zhuǎn)變的報告基因整合到小鼠基因組中，制成轉(zhuǎn)基因小鼠，當皮膚細胞轉(zhuǎn)變成為神經(jīng)細胞后，就可通過熒光或抗生素抗性篩選將需要的神經(jīng)細胞挑選出來，但因轉(zhuǎn)基因技術(shù)不能直接應(yīng)用于人，故此種細胞篩選方法不能應(yīng)用于誘導(dǎo)型人神經(jīng)元細胞的制備；3)普遍認為，要全面評價一類新型細胞的特征和功能，須提供完整的體外和體內(nèi)實驗數(shù)據(jù)，但前述研究在評估小鼠誘導(dǎo)型神經(jīng)元細胞時只開展了體外實驗，未將獲得的功能細胞 移植到體內(nèi)進行分析鑒定，從而缺乏對這一類新細胞特征的完整認識。
技術(shù)實現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷和不足，提供一種從人皮膚細胞直接誘導(dǎo)獲得神經(jīng)元細胞的方法；進一步提供一種從人皮膚細胞直接誘導(dǎo)得到的神經(jīng)元細胞。本專利技術(shù)方法通過將包含重編程轉(zhuǎn)錄因子Sox2、Ascll和Mytll的cDNA導(dǎo)入離體成人皮膚細胞后，篩選表達人神經(jīng)元細胞標記物的細胞克隆，直接制得能穩(wěn)定傳代的誘導(dǎo)型人神經(jīng)元細胞。上述制備方法中，所述的cDNA通過病毒載體導(dǎo)入所述的人皮膚細胞； 所述的人皮膚細胞來源于離體的成人頭皮組織； 所述的病毒載體為慢病毒載體(基礎(chǔ)載體購自美國Addgene公司)； 所述的慢病毒載體以組合形式攜帶的轉(zhuǎn)錄因子包括Sox2、Ascll和Mytll。上述制備方法中，篩選過程是采用流式細胞術(shù)分選多唾液酸-神經(jīng)細胞黏附分子(PSA-NCAM)標記呈陽性的細胞克隆。具體而言，本專利技術(shù)從人皮膚細胞直接誘導(dǎo)獲得神經(jīng)元細胞的方法，其特征在于，包括以下步驟 (1)人皮膚細胞的收集和培養(yǎng) 無菌收集離體成人頭皮組織，按常規(guī)方法經(jīng)酶消化、接種和傳代等步驟培養(yǎng)出成人皮膚細胞； (2)篩選可促成人皮膚細胞轉(zhuǎn)變?yōu)樯窠?jīng)元細胞的關(guān)鍵誘導(dǎo)因子 從與人神經(jīng)發(fā)育密切相關(guān)或在重編程過程中具重要作用的轉(zhuǎn)錄因子中篩選出備選因子,如Ascll、Brn2、Lhx2、Mytll、Pax6、Sox2等,經(jīng)過不同組合的多次測試,本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護點】
一種從人皮膚細胞直接誘導(dǎo)神經(jīng)元細胞的方法，其特征在于，將包含重編程轉(zhuǎn)錄因子Sox2、Ascl1和Myt1l？的cDNA導(dǎo)入成人皮膚細胞后，篩選表達人神經(jīng)元細胞標記物的細胞克隆，直接制得能穩(wěn)定傳代的誘導(dǎo)型人神經(jīng)元細胞；包括步驟：（1）收集和培養(yǎng)人皮膚細胞，所述的人皮膚細胞來源于離體的成人頭皮組織：（2）篩選可促成人皮膚細胞轉(zhuǎn)變?yōu)樯窠?jīng)元細胞的關(guān)鍵誘導(dǎo)因子：從備選因子中：Ascl1、Brn2、Lhx2、Myt1l、Pax6、Sox2，經(jīng)過不同組合的測試，找到關(guān)鍵因子組合：Sox2、Ascl1和Myt1l；（3）構(gòu)建攜帶轉(zhuǎn)錄因子的慢病毒載體：分別將轉(zhuǎn)錄因子Sox2、Ascl1和Myt1l的cDNA連接到慢病毒穿梭質(zhì)粒表達載體上；用293T細胞進行病毒包裝和生產(chǎn)；用綠色熒光蛋白作為報告基因；（4）病毒感染離體成人皮膚細胞：采用步驟（3）所獲得的病毒液，感染步驟（1）獲得的成人皮膚細胞，培養(yǎng)1天后將細胞轉(zhuǎn)置于不含病毒液的神經(jīng)元細胞培養(yǎng)液中；（5）篩選表達人神經(jīng)細胞標志蛋白的細胞克?。禾暨x具有典型神經(jīng)元形態(tài)的細胞，篩選出表達人神經(jīng)細胞標志蛋白PSA？NCAM的陽性細胞克隆。

【技術(shù)特征摘要】

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：朱劍虹，王璞，沙紅英，徐成仕，吳惺，
申請(專利權(quán))人：復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院，
類型：發(fā)明
國別省市：