本發明專利技術公開了一種焦磷酸測序法檢測抗葉酸類制劑個體化用藥基因多態性的試劑盒及方法。具體是指DPYD(rs3918290)和MTHFR(rs1801133)單核苷酸多態性。試劑盒包含如SEQIDNO.3—8所示的引物。本發明專利技術的試劑盒，可以實現準確、快捷、高通量DPYD(rs3918290)和MTHFR(rs1801133)的檢測，從而達到對抗葉酸類制劑用藥實現安全合理有效的個體化給藥。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于分子生物學領域，具體涉及。
技術介紹
5-氟尿嘧啶(5-FU)目前仍然是使用最廣泛的抗葉酸類抗腫瘤藥物，用于多種實體腫瘤，如結直腸癌、乳腺癌等的藥物治療。5-FU可使部分患者得到顯效治療，但常伴隨者嚴重的胃腸道毒副作用和血液毒性反應，甚至導致治療失敗。5-FU在體內大部分經過二氫嘧啶脫氫酶(DPD)代謝失活，少部分是經過胸苷磷酸化酶(TP)代謝成其活性代謝產物2’ -脫氧-5-氟尿嘧啶磷酸鹽(2’ -dFUMP)。除5-FU外，氟化嘧啶類藥物如卡培他濱、替加氟、卡莫氟、氟尿苷、脫氧氟尿苷等，是5-FU的前藥，需在體內轉化成5-FU起抗腫瘤作用。 二氫嘧啶脫氫酶是5-FU催化代謝限速酶，85%的5_FU經其代謝成非活性代謝產物。因此，遺傳導致的酶活性不足，可導致代謝改變和嚴重藥物毒性反應。二氫嘧啶脫氫酶編碼的基因是DPYD，為人lp22染色體上，長950bp，有23個外顯子。至今已發現超過30種SNPs和缺失突變，大多數對DH)酶功能無影響，少部分使酶活性降低，甚至導致酶功能缺失。最常見的可導致嚴重毒性反應的突變是14外顯子1986位A — G改變(DPYD*2A等位基因，rs3918290)，其編碼的產物為無活性的酶。酶活性嚴重降低，導致5-氟尿嘧啶在體內蓄積，引起嚴重粘膜炎、粒細胞減少癥、神經系統癥狀甚至死亡。大量研究表明，DH)酶活性降低的患者中有40%攜帶DPYD*2A基因突變，其中有60%的患者5-FU治療后發生4級嚴重的粒細胞減少血液毒性。DH)酶活性正常患者經5-FU治療后只有10%發生嚴重毒副反應。因此，DH)基因分型可能是一種預測5-FU治療導致致命毒性反應發生概率的有效遺傳分析手段，為臨床醫生制定藥物治療方案提供參考。亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)是葉酸代謝過程中的關鍵酶，它將5，10-MTHF轉變成5-甲基四氫葉酸(5-MTHF)。葉酸抑制劑(5-氟尿嘧啶、培美曲塞、卡培他濱、替加氟等)的抗癌活性與腫瘤細胞內5，10-亞甲基四氫葉酸濃度呈正相關。因此，MTHFR的活性將直接影響體內5，10-MTHF的濃度，從而影響葉酸抑制劑的抗癌作用。MTHFR基因位于I號染色體，具有多態性，最常見的突變是位于4號外顯子的rsl801133。rsl801133發生頻率較高，普通人群AA突變純合子發生率為25%。具有AA型突變等位基因的患者，MTHFR酶活性的下降使得細胞內亞甲基四氫葉酸積聚，增強了 5-FU活性代謝產物5-FdUMP對胸苷酸合成酶的抑制作用，導致了嚴重的骨髓抑制不良反應。有研究表明，5-FU治療后，AA型患者77%產生了 3-4級毒性反應，GA和GG型患者出現這種毒性反應的只有6%和8%，突變純合子產生毒性反應的概率是其它基因型的9到12倍。因此，MTHFR是也是預測5-FU療效的因子。綜上所述，DPYD和MTHFR基因多態性是影響抗葉酸類制劑需求劑量差異性的主要因素，開發快速、高效、準確、便捷、經濟的檢測DPYD和MTHFR基因多態性的試劑盒將為抗葉酸類制劑的臨床個體化治療起到積極的推動作用。焦磷酸測序(Pyro sequencing)技術是新一代DNA序列分析技術,該技術無須進行電泳，DNA片段也無須熒光標記，是一種通用型技術平臺。該技術具有操作簡便、檢測成本低、所需樣品量小、快捷、準確、高通量等特點，符合臨床大樣本檢測要求。
技術實現思路
DPYD (rs3918290)和MTHFR (rsl801133)基因多態性是影響抗葉酸類制劑劑量個體差異的最主要因素。本專利技術提供一種檢測影響臨床抗葉酸類制劑個體化用藥治療的用藥基因DPYD (SEQ ID NO. I)和MTHFR (SEQ ID NO. 2)多態性的試劑盒及方法，以實現快速、簡便、準確、高效、實用、經濟的檢測抗葉酸類制劑個體化用藥相關基因SNP。為了達到上述目的，本專利技術提供的技術方案為 所述焦磷酸測序法檢測抗葉酸類制劑個體化用藥基因多態性的試劑盒，包括如下引物 (1)擴增引物 DPYD (rs3918290)上游引物5’ - GGT GTC AAA GTG TCA CTG AAC TA -3’ (SEQ IDNO. 3)； MTHFR (rsl801133)上游引物:5，_ AAG GCC ACC CCG AAG CAG GGA GCT -3，(SEQ IDNO. 4)； DPYD (rs3918290)下游引物5’ - CTC TTG TTT TAG ATG TTA AAT CAC -3，(SEQ IDNO. 5)； MTHFR (rsl801133)下游引物5’ -GGG GAC GAT GGG GCA AGT -3，(SEQ ID NO. 6)； 其中，DPYD下游引物的5’進行生物素標記，MTHFR上游引物5’標記生物素； (2)測序引物 DPYD (rs3918290)測序引物5，- GCT GAC TTT CCA GAC AAC -3，(SEQ ID NO. 7)；MTHFR (rsl801133)測序引物5’ - CGT GAT GAT GAA ATC G -3’ (SEQ ID NO. 8)；在實際應用中，可以對上述引物作適當改變，只要保證設計的引物與上述引物同源性達95%以上即可；試劑盒中其他試劑及溶液為PCR和DNA焦磷酸測序的常規試劑。所述應用權利要求I所述的試劑盒檢測抗葉酸類制劑用藥基因多態性的方法，包括如下步驟 (1)DNA 提取； (2)聚合酶鏈反應 配制 50 ill PCR 擴增體系，包含10 X PCR buffer 10. 0 u I, dNTP 2. Oyl，上游引物l.Oul,下游引物 l.Oiil，rTaql. OiU，水 31. OiU，模板 4. OiU ;循環程序為95°C 5min預變性；依次在95°C 30S,52°C 30S,72°C 30S，進行38個循環;72°C保持5min，最終保持在4 °C，得擴增產物； (3)焦磷酸測序單鏈樣本純化； (4)焦磷酸測序及結果分析。本專利技術的試劑盒對DPYD (rs3918290)目標序列和MTHFR (rsl801133)目標序列進行分析和檢測；其中，DPYD (rs3918290)目標序列包括野生型AACGTAAGTGTG (SEQID NO. 9)和突變型 AACATAAGTGTG (SEQ ID NO. 10)，擴增出的片段長度為 74bp ；MTHFR(rsl801133)目標序列包括野生型 GCTCCCGC (SEQ ID NO. 11)和突變型 ACTCCCGC (SEQID NO. 12)，擴增出的片段長為167bp。由于設計了特異性高的引物，并且選擇了合適的方法，本專利技術的試劑盒適用于對抗葉酸類制劑個體化用藥基因進行快速檢測，可廣泛應用于臨床上抗葉酸類制劑個體化用藥方案制定的基因檢測。與現有技術相比，其應用焦磷酸測序技術可以快速、準確地進行短DNA序列分析，便于構建標準化操作流程；具 有高通量、低成本等特點；PCR產物即可直接用于測序，不需進行產物純化等二次處理，操作極為簡便，所需樣品量小。附圖說明圖I為本專利技術DPYD rs3918290野本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種焦磷酸測序法檢測抗葉酸類制劑個體化用藥基因多態性的試劑盒，其特征在于，包括如下引物：（1）擴增引物：？？？？？上游引物：5’？GGT？GTC？AAA？GTG？TCA？CTG？AAC？TA？3’；？？？？？？？？？？5’？？AAG？GCC？ACC？CCG？AAG？CAG？GGA？GCT？？3’，該引物5’標記生物素；？？下游引物：5’？CTC？TTG？TTT？TAG？ATG？TTA？AAT？CAC？3’，該引物5’標記生物素；？？？？？？？？？？？？？？？5’？？GGG？GAC？GAT？GGG？GCA？AGT？？3’；（2）測序引物：5’？？GCT？GAC？TTT？CCA？GAC？AAC？？3’；？？？？？？？？？？？？？？？5’？？CGT？GAT？GAT？GAA？ATC？G？？3’。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：周宏灝，
申請(專利權)人：周宏灝，
類型：發明
國別省市：
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