本發明專利技術公開了一種檢測運動機能相關基因ACTN3熒光檢測試劑盒，屬于生物檢測技術領域。該試劑盒包括擴增前試劑和擴增后試劑；所述擴增前試劑包括：PCR緩沖液、MgCl2和dNTPs的反應混合物，Taq酶，超純水，高特異性擴增ACTN3基因熱點突變的引物混合物；所述擴增后試劑包括：基因分型標準物和內標。本發明專利技術以上述基因為檢測對象，通過PCR擴增，毛細管電泳檢測，與基因分型標準物的對比，即可進行基因分型，篩選出具有特定基因型的個體，為體育選材提供參考。在體育選材方面首次采用了熒光標記技術、毛細管電泳技術實現對運動機能相關基因的高靈敏度特異性檢測，大大節約了人力物力和時間。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及一種運動機能基因ACTN3熒光檢測試劑盒及檢測方法，屬于生物檢測
技術介紹
隨著人類基因組計劃的完成，后基因組計劃的全面展開，以基因工程為主導的生物技術在體育運動問題領域的應用得到廣泛的關注。基因遺傳工程應用于運動員選材是歷史必然、大勢所趨，它必將從根本上引起運動選材理論和方法的革命。運用遺傳學的理論和方法進行運動選材已經有了初步進展。 研究發現，ACTN3基因確與肌肉爆發力相關，能在早期對運動員的爆發力發展有準確的預測。將ACTN3基因技術應用在運動員選材領域，不僅能夠提高選材的準確率，還能大大減少優秀運動員的培養成本，更重要的是實現早期訓練項目定位，即能有效地提高成材率。ACTN(a_輔肌動蛋白)是肌動蛋白的結合蛋白，主要分布于肌纖維Z線附近(類似致密體)幫助定位肌原纖維肌動蛋白微絲。ACTN有ACTN1、2、3、4種存在形式，人類只有ACTN2和ACTN3。ACTN2存在于骨骼肌和心肌中，ACTN3僅存在于骨骼肌快肌纖維中。已證實，ACTN3基因16號外顯子的1747核苷酸發生C — T突變而產生終止密碼子，取代577R氨基酸殘基的精氨酸，形成577X，使得ACTN3蛋白缺失，影響肌肉拉伸速度，降低爆發力，約16%的人存在此多態。ACTN3T等位基因阻止該蛋白質的完全制造。有兩個T等位基因的人將不能在他們的快縮肌纖維中制造α肌動蛋白3，因而在爆發力方面處于劣勢，那些CT基因型因為有一個功能性的基因，因而還能制造α肌動蛋白3。而CC基因型則由于擁有兩個ACTN3基因而擁有其他人無法比擬的基因條件。ACTN3基因多態性與爆發力素質有相關性，CC純合型速度素質優于CT、TT型，研究者認為577R可以作為爆發力相關項目運動員的基因選材指標。目前常用的基因檢測方法有直接測序(direct sequencing, DS)、連接酶檢測反應(ligase detection reaction, LDR)、限制性片段長度多態性分析(restrictionfragment length polymorphism, RFLP)> 變性高效液相色譜分析(denaturing highperformance liquid chromotography,DHPLC)、定量PCR。這些方法都存在不同的缺陷，例如操作繁瑣、結果不易判讀、重復性差、假陰性假陽性多等問題。采用熒光標記技術、毛細管電泳技術，通過帶不同熒光標記物的引物對運動機能相關基因ACTN3特異性的擴增，而后經毛細管電泳后分析PCR產物出峰情況，即可實現對該運動機能相關基因位點的檢測，靈敏度高、判讀清晰準確、采樣方便。
技術實現思路
本專利技術的目的是提供一種運動機能基因ACTN3熒光檢測試劑盒及檢測方法。本專利技術所述的檢測運動機能相關基因ACTN3熒光檢測試劑盒，包括擴增試劑和擴增后的基因分型用試劑；所述擴增前試劑包括PCR緩沖液、MgCl2, dNTPs的混合物，Taq酶，引物混合物以及超純水；所述擴增后試劑包括內標和用于基因分型的基因分型標準物；使用所述的試劑盒進行PCR擴增反應的條件PCR擴增體系的pH值為8. 0-9. 0，鎂離子濃度為I. 5-3. 5mM，4種dNTP的終濃度各為200-300 μ Μ, Taq酶的用量為O. 1-0. 4U/μ L，引物終濃度為O. 2-0. 4 μ M0用于ACTN3基因檢測的引物為SEQ NO. I :5’ -TTT CTG TTG CCT GTG GTAAGT GG-3’ ； SEQ NO. 2 :5’ -GTTAGAT GGC ACC TCG CTC TCA-3’SEQ NO. 3 :5，-GAT GGC ACC TCG CTC TCG-3’ ；所述的引物中SEQ NO. I的5’端進行熒光染料標記，內標所用的熒光染料為不同的熒光素。所述擴增采用聚合酶鏈式反應來實現，采用多道或單道毛細管電泳進行檢測。采用所述試劑盒應用于運動機能相關基因檢測的方法，是通過熒光引物PCR及毛細管電泳特異性檢測運動機能相關基因ACTN3 ;用于ACTN3檢測的引物為SEQ NO. I、SEQNO. 2、SEQ NO. 3，所述基因的擴增采用聚合酶鏈式反應來實現，采用多道或單道毛細管電泳進行檢測。其中所檢測的人基因組DNA為使用Chelex法、磁珠提取法或酚/氯仿抽提法對來源樣本進行處理得到的DNA ;所述的來源樣本為來源于人類的濾紙片血斑/ 口腔拭子樣本、FTA卡血斑/ 口腔拭子樣本、口腔拭子樣本、血液。使用所述的試劑盒進行PCR擴增時，擴增階段反應在任何型號的PCR儀上進行，擴增程序:94-980C l-5min ;26_32 個循環的 94-98°C 15-60s, 55-65 °C 15-60s,72°C 15_60s ；60 °C 30-60min。本專利技術的有益效果如下本專利技術以ACTN3基因為檢測對象，通過PCR擴增，毛細管電泳檢測，與基因分型標準物的對比，即可進行基因分型，篩選出具有特定基因型的個體，為體育選材提供參考。在體育選材方面首次采用了熒光標記技術、毛細管電泳技術實現對運動機能相關基因的高靈敏度特異性檢測，大大節約了人力物力和時間。附圖說明圖I是本專利技術試劑盒對71-2號樣本ACTN3基因個體DNA擴增后的分型結果圖；圖2是本專利技術試劑盒對73-4號樣本ACTN3基因個體DNA擴增后的分型結果圖；圖3是本專利技術試劑盒對87號樣本ACTN3基因個體DNA擴增后的分型結果圖。具體實施例方式以下結合實施例對本專利技術做進一步描述。實施例I本專利技術的試劑盒檢測40個不同個體的DNA樣本。用于運動機能相關基因檢測的引物采用藍色熒光染料標記，內標采用紅色熒光染料標記。I、待測樣本40份，下文列舉的是不同基因型個體3份的結果。相關樣本都已經使用“DNA提取-PCR擴增-測序”的技術方法對ACTN3進行過測序檢測。其中，71_2號、73_4號、87號樣本的分型結果依次為C/T、T/T、C/C。2、檢材的基因組DNA提取Chelex提取法剪下I 3mm血斑置于I. 5mL離心管中，加入SdH2O ImL,振蕩離心，棄上清液，重復步驟兩次，棄上清液，將5%Chelex-100震蕩懸浮后快速用剪掉的槍頭吸取200 μ L加入離心管中，振蕩數秒，。于56°C水浴保溫30min后，振蕩數秒。95°C沸水浴IOmin,輕微振蕩數秒。2000rpm離心5min,上清中為提取的DNA。3、擴增和擴增產物的檢測分析3. IPCR 擴增體系 組分體積(μι) 組分說明 Reaction Mix 10含 pH 為 8.3 的 2.5xPCR 緩沖液、 7.5 πιΜ 的 MgCl2 >750 μΜ dNTP ___Mix_Taq 酶 (5υ/μΡ_____ Primers5本專利技術的引物對(0.2uM) 模板^ 0.2-5.0ng orfTT π補足至 SdH2O __25.0μ^__3. 2PCR 擴增程序初始熱循環終延 變性___1Ψ_95V30 個循環:60V—5mill98°C 30s, 59°C 30s, 72°C 60min _[30s__4、擴增產物在遺傳分析儀上熒光檢測由去離子甲酰胺與本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種運動機能基因ACTN3熒光檢測試劑盒，其特征在于包括DNA聚合酶及其緩沖溶液、擴增基因的引物、內標及基因分型標準物。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：步迅，夏子芳，
申請(專利權)人：山東百福基因科技有限公司，步迅，夏子芳，
類型：發明
國別省市：
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