本發明專利技術涉及胎盤全細胞分離、凍存和復蘇以及復蘇后干細胞分離和擴增的方法，其包括如下步驟：對胎盤組織進行消毒和清洗；從組織剪下胎盤小葉，消化處理20分鐘；配制胎盤組織凍存液備用；將消化處理得到的全細胞和凍存液加入凍存管中，在4℃的溫度條件下低溫冷藏0.5小時，再-80℃的溫度條件下冷凍1天，然后液氮中冷凍備用；需要時將胎盤全細胞從液氮中取出，恒溫水浴解凍，利用間充質干細胞培養基進行點滴法清洗，利用紅細胞裂解液清除紅細胞，復蘇的胎盤全細胞可通過細胞培養和細胞傳代擴增間充質干細胞。本發明專利技術方法可有效保護凍存胎盤組織，且方便復蘇使用，尤其適合復蘇后分離和擴增間充質干細胞。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及對胎盤全細胞進行處理的方法，具體涉及對胎盤全細胞凍存、復蘇處理，以及由復蘇后的胎盤全細胞分離和擴增干細胞的方法，特別涉及對胎盤全細胞進行凍存、復蘇，然后再從中分離和擴增間充質干細胞的方法。
技術介紹
間充質干細胞(mesenchymal stem cells, MSC)來源于發育早期的中胚層和外胚層，具有多向分化潛能、免疫調節和自我復制等特點，日益受到人們的關注。間充質干細胞在體內或體外特定的誘導條件下，可分化為脂肪、骨、軟骨、肌肉、肌腱、韌帶、神經、肝、心肌、內皮等多種組織細胞，連續傳代培養和冷凍保存后仍具有多向分化潛能，可作為理想的種子細胞用于衰老和病變引起的組織器官損傷修復，尤其對治療衰老和組織器官損傷修復有很大的臨床應用價值。 MSC在骨髓中蘊含豐富，但隨著年齡的老化，骨髓中的干細胞數目也會顯著降低、增殖分化能力亦大幅度衰退。另外，骨髓MSC移植給異體可能引起免疫反應，且提取干細胞過程對患者的損傷性和在采集時遇到的其他問題，都直接影響了骨髓MSC的臨床應用，使得尋找骨髓以外其他可替代的間充質干細胞來源成為一個重要的問題。近期的研究顯示，胎盤組織中也含有間充質干細胞并且能成功分離。這種組織來源的間充質干細胞不僅保持了間充質干細胞的生物學特性，而且分離出來的干細胞更原始，有更強的增殖分化能力。其免疫細胞的功能活性低，大大減低了觸發免疫反應及引起移植物抗宿主病的風險。潛伏性病毒和微生物的感染及傳播幾率比較低。采集過程簡單，對產婦及新生兒無任何危害及損傷。以上原因足以令胎盤間充質干細胞成為骨髓間充質干細胞的理想替代物。但是，胎盤組織分離干細胞的方法和技術還不是完全成熟，而且每一份胎盤組織的處理和分離后的細胞培養都需要一定的時間和人員的消耗。因此將胎盤組織凍存并且在有需要的時候復蘇進行干細胞分離的做法相對更符合成本效益。因此，本領域需要一個簡單和高效的胎盤組織凍存、復蘇和間充質干細胞的分離和擴增的方法，以滿足醫藥、科研、臨床等領域的需求。
技術實現思路
本專利技術的目的是解決現有技術凍存、復蘇胎盤全細胞方法的缺陷，提供一種簡單有效的胎盤全細胞凍存的方法，以及相配套使用的凍存胎盤全細胞復蘇的方法，以及復蘇后間充質干細胞擴增的方法。本專利技術發現對胎盤全細胞使用特定操作步驟的凍存、復蘇以及分離和擴增，可簡單、有效地從胎盤組織例如胎盤全細胞分離原代間充質干細胞，并且可以對原代間充質干細胞在凍存過程中有效地進行保護。本專利技術基于此發現而得以完成。因此，本專利技術第一方面提供了處理胎盤全細胞的方法，該方法包括以下對胎盤離體新鮮組織全細胞進行分離和凍存的步驟(I)胎盤組織清洗通過緩沖液(例如PBS緩沖液)清洗胎盤組織，使胎盤組織表面殘留血液沖洗干凈，胎盤表面無血液凝塊；(2)胎盤組織消化處理從步驟(I)得到的胎盤組織上剪下胎盤小葉，加入緩沖液(例如PBS緩沖液)并將小葉剪碎，加入消化酶溶液(例如其非限制性地包含胰酶)中，消化處理5-40分鐘(例如10-30分鐘，例如約20分鐘)；(3)胎盤組織過濾處理加入FBS溶液(Gibco)終止消化，將消化處理后的胎盤組織碎片轉移至過濾裝置，對胎盤組織碎片進行研磨，同時收集濾液，對濾液進行細胞清洗；(4)配制胎盤全細胞凍存液所述胎盤全細胞凍存液中包含人血白蛋白、DMSO(二甲基亞砜)和DMEM-F12，配好的凍存液放在1°C至7 V (例如約4°C )的溫度條件下低溫冷藏；(5)胎盤全細胞凍存將步驟⑶得到的胎盤組織過濾液離心后去除上清液，在0-15°C (例如1°C至TC，例如約4°C )的低溫環境下，加入步驟⑷得到的全細胞凍存液，·然后轉移至凍存容器中，凍存容器放入程序降溫裝置，先在1°C至TC (例如4°C)的溫度條件下低溫冷藏O. 2-2小時(例如約O. 5小時)，再在-10°C至_150°C (例如約_80°C )的溫度條件下冷凍O. 25-3天(例如約I天)，然后將凍存容器于液氮中冷凍，備用。根據本專利技術第一方面的方法，該方法還包括以下對凍存的胎盤離體新鮮組織全細胞進行復蘇的步驟(6)凍存胎盤全細胞復蘇將步驟(5)冷凍的胎盤全細胞從液氮中取出，解凍至20%-70%(例如50%)凍存液開始融化，利用間充質干細胞培養基清洗細胞，離心處理清洗DMS0，去除上清液，進行紅細胞裂解步驟，離心處理后去除上清液，觀察紅細胞裂解情況，如有需要再重復紅細胞裂解的步驟進行裂解，最后進行細胞清洗步驟，去除上清液。根據本專利技術第一方面的方法，該方法還包括以下對復蘇的胎盤全細胞進行間充質干細胞分離和擴增的步驟(7)細胞培養向步驟(6)得到的全細胞中補加適量的間充質干細胞培養基重懸細胞，接種至培養容器，再將培養容器放進培養箱中進行培養，培養至第4-7天(例如第5天，例如第6天，例如第7天)時將培養容器從培養箱中取出，進行第一次半換液，繼續培養，在第8-10天(例如第9天)時將培養容器從培養箱中取出，進行第二次半換液，繼續培養，在第11-13天(例如第12天)時將培養容器從培養箱中取出，加入5-20ml (例如10-18ml，例如15ml)間充質干細胞培養基，往后每1-4天(例如2-3天)進行一次全換液；(8)細胞傳代當培養容器中的貼壁細胞融合率達到40%_90%(例如80%)以后，利用消化酶(例如TrypLe Express)將貼壁細胞脫離容器底部,離心,抽走上清液,加入充質干細胞培養基重新懸浮細胞，再接種于培養容器進行傳代并進行擴增培養，此后每1-3天(例如每2天)換液一次，直至融合率達到70-90%(例如80%)后，即得胎盤間充質干細胞，必要時進行傳代；以及任選的下列一個或多個步驟(9)對針對步驟(8)所得胎盤間充質干細胞，檢測以下項目的至少一項細胞活性、細胞污染、遺傳病、HLA-ABC/DR配型；(10)將步驟⑶所得傳代后的胎盤間充質干細胞于液氮中冷凍，備用。根據本專利技術第一方面的方法，該方法包括(A)以下對胎盤離體新鮮組織全細胞進行分離和凍存的步驟(I)胎盤組織清洗通過緩沖液(例如PBS緩沖液)清洗胎盤組織，使胎盤組織表面殘留血液沖洗干凈，胎盤表面無血液凝塊；(2)胎盤組織消化處理從步驟⑴得到的胎盤組織上剪下胎盤小葉，加入緩沖液(例如PBS緩沖液)并將小葉剪碎，加入消化酶溶液(例如其非限制性地包含胰酶)中，消化處理5-40分鐘(例如10-30分鐘，例如20分鐘)；(3)胎盤組織過濾處理加入FBS溶液終止消化，將消化處理后的胎盤組織碎片轉移至過濾裝置，對胎盤組織碎片進行研磨，同時收集濾液，對濾液進行細胞清洗；(4)配制胎盤全細胞凍存液所述胎盤全細胞凍存液中包含人血白蛋白、DMSO(二甲基亞砜)和DMEM-F12，配好的凍存液放在1°C至7°C (例如4°C )的溫度條件下低溫冷藏； (5)胎盤全細胞凍存將步驟(3)得到的胎盤組織過濾液離心后去除上清液，在0-15°C (例如1°C至TC，例如4°C )的低溫環境下，加入步驟(4)得到的全細胞凍存液，然后轉移至凍存容器中，凍存容器放入程序降溫裝置，先在1°C至TC (例如4°C)的溫度條件下低溫冷藏O. 2-2小時(例如O. 5小時)，再在-10°C至_150°C (例如_80°C )的溫度條件下冷凍O. 25-3天(例如I天)，然后將凍存本文檔來自技高網...
【技術保護點】
處理胎盤全細胞的方法，該方法包括：(A)以下對胎盤離體新鮮組織全細胞進行分離和凍存的步驟：(1)胎盤組織清洗：通過緩沖液(例如PBS緩沖液)清洗胎盤組織，使胎盤組織表面殘留血液沖洗干凈，胎盤表面無血液凝塊；(2)胎盤組織消化處理：從步驟(1)得到的胎盤組織上剪下胎盤小葉，加入緩沖液(例如PBS緩沖液)并將小葉剪碎，加入消化酶溶液(例如其非限制性地包含胰酶)中，消化處理5？40分鐘(例如20分鐘)；(3)胎盤組織過濾處理：加入FBS(Gibco)溶液終止消化，將消化處理后的胎盤組織碎片轉移至過濾裝置，對胎盤組織碎片進行研磨，同時收集濾液，對濾液進行細胞清洗；(4)配制胎盤全細胞凍存液：所述胎盤全細胞凍存液中包含人血白蛋白、DMSO(二甲基亞砜)和DMEM？F12，配好的凍存液放在1℃至7℃(例如4℃)的溫度條件下低溫冷藏；(5)胎盤全細胞凍存：將步驟(3)得到的胎盤組織過濾液離心后去除上清液，在0？15℃(例如1℃至7℃，例如4℃)的低溫環境下，加入步驟(4)得到的全細胞凍存液，然后轉移至凍存容器中，凍存容器放入程序降溫裝置，先在1℃至7℃(例如4℃)的溫度條件下低溫冷藏0.2？2小時(例如0.5小時)，再在？10℃至？150℃(例如？80℃)的溫度條件下冷凍0.25？3天(例如1天)，然后將凍存容器于液氮中冷凍，備用；任選地，進一步進行(B)以下對凍存的胎盤離體新鮮組織全細胞進行復蘇的步驟：(6)凍存胎盤全細胞復蘇：將步驟(5)冷凍的胎盤全細胞從液氮中取出，解凍至20%？70%(例如50%)凍存液開始融化，利用間充質干細胞培養基清洗細胞，離心處理清洗DMSO，去除上清液，進行紅細胞裂解步驟，離心處理后去除上清液，觀察紅細胞裂解情況，如有需要再重復紅細胞裂解的步驟進行裂解，最后進行細胞清洗步驟，去除上清液；任選地，進一步進行(C)以下對復蘇的胎盤全細胞進行間充質干細胞 分離和擴增的步驟：(7)細胞培養：向步驟(6)得到的全細胞中補加適量的間充質干細胞培養基重懸細胞，接種至培養容器，再將培養容器放進培養箱中進行培養，培養至第4？7天(例如第5天，例如第6天，例如第7天)時將培養容器從培養箱中取出，進行第一次半換液，繼續培養，在第8？10天(例如第9天)時將培養容器從培養箱中取出，進行第二次半換液，繼續培養，在第11？13天(例如第12天)時將培養容器從培養箱中取出，加入5？20ml(例如10？18ml，例如15ml)間充質干細胞培養基，往后每1？4天(例如2？3天)進行一次全換液；(8)細胞傳代：當培養容器中的貼壁細胞融合率達到40%？90%(例如80%)以后，利用消化酶(例如TrypLe？Express)將貼壁細胞脫離容器底部，離心，抽走上清液，加入充質干細胞培養基重新懸浮細胞，再接種于培養容器進行傳代并進行擴增培養，此后每1？3天(例如每2天)換液一次，直至融合率達到70？90%(例如80%)后，即得胎盤間充質干細胞，必要時進行傳代；以及任選的下列一個或多個步驟：(9)對針對步驟(8)所得胎盤間充質干細胞，檢測以下項目的至少一項：細胞活性、細胞污染、遺傳病、HLA？ABC/DR配型；(10)將步驟(8)所得傳代后的胎盤間充質干細胞于液氮中冷凍，備用。...
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：林卓衡，朱業峰，陳俊峯，周丹，
申請(專利權)人：博雅干細胞科技有限公司，
類型：發明
國別省市：
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