本發明專利技術公開了一個特異追蹤簇毛麥6VS染色體的分子標記6VS-SPB及其用法，它涉及分子生物學和遺傳育種科學技術領域。該標記引物是根據小麥第6部分同源群短臂的EST序列BE499423設計，具體序列為6VS-SPBF：5’-TCATGCTTTAGCTGAGTTTGACCAGA-3’，6VS-SPBR：5’-GAACTTCCACAGCTTCTCATTTGAACAT-3’，以標記引物進行PCR時能擴增出一條900bp的特異性DNA條帶，能有效追蹤簇毛麥6VS染色體及其控制的抗小麥白粉病性狀，在小麥抗白粉病分子標記輔助選擇育種中具有潛在的應用價值。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及分子生物學和遺傳育種科學
，具體涉及一個特異追蹤簇毛麥6VS染色體的分子標記及其用法。
技術介紹
小麥是全球三大糧食作物之一，也是我國總產第一的糧食作物，是保障我國糧食安全的重要決定因素之一。小麥在其生育進程中常會受到生物或非生物脅迫的影響。小麥白粉病是一種世界性小麥病害，近年來隨著我國農田水利設施改善和水肥條件提高，其危害逐年加重。通過遠緣雜交和染色體工程技術手段育成的小麥-簇毛麥T6AL. 6VS易位系對目前已發現的白粉病生理小種均表現高抗或免疫，其抗白粉病基因位于簇毛麥6V染 色體短臂上(6VS)，是目前對小麥白粉病抗譜最廣、抗性最強的基因。近年來T6AL. 6VS易位系在小麥抗白粉病新品種選育中得到廣泛利用，目前已育成20多個抗白粉病小麥新品種，推廣面積超過5000萬畝。T6AL. 6VS易位系是在普通小麥遺傳背景中由簇毛麥6V染色體短臂(6VS)替換了普通小麥6A染色體的短臂(6AS)，從而形成T6AL. 6VS易位染色體。由于簇毛麥與普通小麥親緣關系較遠，導致二者不發生染色體重組，T6AL. 6VS易位染色體始終以易位的形式出現在后代中。目前，未發現利用T6AL. 6VS易位系培育的新品種或新品系中出現染色體易位形式的改變。因此，簇毛麥6VS控制的性狀及其載有的DNA序列均以協同傳遞的方式出現在后代中。目前，部分研究已公布了部分與6VS上抗白粉病基因Pm21連鎖的相關分子標記OPT171400,OPT171900 ,SCAR1400,SCAR1265,NAU/XiBao15902 和 NAU/XiBaol61586。但是，總體而言，這些標記在標記輔助選擇育種中都存在不穩定的缺點，一個原因是由標記類型決定的，如RAPD標記0PT1714(KI和0PT1719(i(i ;其次是由于PCR反應體系和反應條件要求苛刻，PCR結果可重復性差造成的。這些缺點均不利于標記輔助選擇技術在小麥育種實踐中的應用。EST (expressed sequence tag,表達序列標簽)是指從植物不同組織來源的cDNA文庫中隨機挑選克隆，對其5’和3’端進行測序獲得的短cDNA序列。EST-STS(sequence-tagged site, STS)標記是直接依據已經定位于基因組物理圖上的EST序列設計引物，對基因組或者cDNA進行擴增，從中尋找與目的基因連鎖或具有染色體特異性的EST標記。由于EST-STS標記直接來源于表達基因序列，保守性較高，特別有利于界定物種之間的差異。因此，基于比較基因組學原理，利用普通小麥EST圖譜，同樣可以開發普通小麥親緣物種簇毛麥特定染色體的特異性分子標記。本專利技術就是基于上述思想指導下，利用比較基因組學原理，根據普通小麥bin-map圖譜上第6部分同源群短臂上的EST序列設計以PCR技術為基礎的EST-STS標記，篩選簇毛麥6V染色體短臂(6VS)特異性分子標記，用于快速檢測和追蹤普通小麥遺傳背景中T6AL. 6VS易位染色體及其控制的抗白粉病性狀，為小麥抗白粉病分子標記輔助選擇育種提供新型、實用、高效的分子標記。
技術實現思路
本專利技術的目的是提供一種特異追蹤簇毛麥6VS染色體的分子標記及其用法，它利用比較基因組學原理，根據普通小麥bin-map圖譜上第6部分同源群短臂的EST序列，設計以PCR技術為基礎的EST-STS標記引物，篩選簇毛麥6VS染色體特異性分子標記，為抗白粉病小麥-簇毛麥T6AL. 6VS易位系在小麥抗白粉病新品種培育中的應用提供一種新型、實用、高效的分子標記輔助選擇技術。為了解決
技術介紹
所存在的問題，本專利技術是采用以下技術方案它是根據普通小麥bin-Map圖譜第6部分同源群短臂的EST序列BE499423設計得到的，標記引物擴增出的一段約900bp的DNA條帶位于簇毛麥6VS染色體，可以特異地追蹤6VS染色體及其控制的抗小麥白粉病性狀，標記引物序列為6VS-SPBF :5’-TCATGCTTTAGCTGAGTTTGACCAGA-3’ (SEQ ID NO. I), 6VS-SPBR :5’ -GAACTTCCACAGCTTCTCATTTGAACAT-3’ (SEQ ID NO. 2)。本專利技術還公開了所述的簇毛麥6VS染色體特異的分子標記6VS-SPB在追蹤小麥-簇毛麥T6AL. 6VS易位染色體中的用途。用所述的簇毛麥6VS染色體特異的分子標記6VS-SPB追蹤小麥-簇毛麥T6AL. 6VS易位染色的方法，是用該分子標記引物對待測材料進行PCR擴增，擴增出900bp條帶的材料，為含有小麥-簇毛麥T6AL. 6VS易位染色體的材料。本專利技術所述分子標記的具體用法為 (1)PCR反應體系:IOmL反應體系中含約10 20ng模板DNA，I XPCR buffer, I. 5mmolΓ1 MgCl2, 200mmol Γ1 dNTP，兩條引物終濃度各為0. 2mmol Λθ. 5U Taq DNA聚合酶，用無菌蒸懼水補充反應體系至IOmL ； (2)PCR反應程序94°C預變性3分鐘；94°C變性20秒，60°C退火30秒，72°C延伸60秒，32個循環；72°C延伸5分鐘；4°C保存； (3)PCR產物檢測PCR擴增產物經6%非變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離，用銀染法染色。本專利技術在利用T6AL. 6VS易位系為親本進行抗白粉病性狀的追蹤時，凡是擴增出900bp條帶的材料，都含有小麥-簇毛麥T6AL. 6VS易位染色體，并對白粉病表現高抗；凡是不能擴增出900bp條帶的材料，都不具有T6AL. 6VS易位染色體，相應丟失由6VS染色體控制的白粉病抗性。本專利技術具有以下有益效果 I、本專利技術的分子標記6VS-SPB在鑒定簇毛麥6VS染色體時特異性強已開發的分子標記0PT1714(i(i和0PT1719(i(i都非6VS特異性標記，只有在親本間存在與6VS的多態性時，才可以利用，而使用6VS-SPB時，無論涉及何種親本，只要出現900bp條帶，就可以確定材料中含有6VS染色體。2、本專利技術的6VS染色體特異性EST-STS標記相較SCAR標記更易于識別PCR擴增失敗導致的“假陰性”:本專利技術的標記為共顯性標記，在普通小麥遺傳背景中，無論是否具有T6AL. 6VS易位染色體，都可以擴增出兩條大于IOOObp的背景條帶，可用于判斷PCR擴增是否成功，排除“假陰性”。附圖說明圖I :分子標記 6VS-SPB 的 PCR 擴增結果。M DNA marker DL2000 ；1 :簇毛麥；2 普通小麥；3 :小麥-簇毛麥易位系T6AL. 6VS。箭頭所示為900bp的特異性條帶。具體實施例方式本專利技術具體實施方式采用以下技術方案根據小麥bin-Map圖譜第6部分同源群的EST序列BE499423設計一對標記引物，利用PCR技術擴增出的一段900bp的DNA條帶，該條帶可位于簇毛麥6VS染色體，能特異地追蹤6VS染色體及其控制的抗小麥白粉病性狀。實施例 I、引物的設計與合成 根據美國農部網站http://wheat. pw. usda. gov的信息,搜索定位于普通小麥第6部分 同源群的EST序列,利用Primer Premier 5. O軟件進行引物設計本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一個簇毛麥6VS染色體特異的分子標記6VS？SPB，其特征在于：該分子標記引物序列為：6VS？SPBF：5’？TCATGCTTTAGCTGAGTTTGACCAGA？3’，6VS？SPBR：5’？GAACTTCCACAGCTTCTCATTTGAACAT？3’。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：何華綱，別同德，朱姍穎，洪好，粱瑩，孫衛紅，
申請(專利權)人：江蘇大學，
類型：發明
國別省市：
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