本發明專利技術公開了一種美麗雞血藤EST-SSR分子標記，主要包括：美麗雞血藤EST序列的獲得及預處理、EST序列中SSR位點的篩選、EST-SSR引物的設計、合成與引物篩選。從1573條EST序列中搜索到62條含不同簡單序列重復單元的、符合條件的序列；篩選得到24個多態性豐富的EST-SSR分子標記Ndl_001、Ndl_002、Ndl_003、Ndl_004、Ndl_010、Ndl_011、Ndl_013、Ndl_015、Ndl_019、Ndl_020、Ndl_021、Ndl_022、Ndl_028、Ndl_031、Ndl_032、?Ndl_033、Ndl_038、Ndl_042、Ndl_043、Ndl_047、Ndl_049、Ndl_050、Ndl_051、Ndl_053。本發明專利技術可應用于美麗雞血藤及近緣物種的遺傳多樣性評價，雞血藤屬植物種間和居群間的變異和進化關系的研究、種質鑒定和分子標記輔助育種，重復性好、可靠性高，是一種非常有效的分子標記。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及一種分子標記技術，具體涉及一種美麗雞血藤EST-SSR遺傳標記，適用于美麗雞血藤的遺傳多樣性研究，種質鑒定和親緣關系分析。
技術介紹
微衛星序列(microsatellite DNA)又稱為簡單序列重復(simple sequencerepeats, SSR)，是指以1_6個核苷酸為基本重復單位的串聯重復序列，廣泛存在于各類真核生物基因組中。SSR具有豐富的多態性且均勻分布于整個基因組、以孟德爾方式遺傳、操作簡單、共顯性和重復性好，可進行自動化分析，并用于干燥樣本的分析等優點。微衛星位點可以提供具高分辨率的遺傳信息，這一特點使微衛星既適合于個體水平上的研究，又適合于種群水平上的研究。在個體水平上包括個體識別、交配系統和親本分析、基因流等研究；在種群水平上微衛星可用于遺傳結構、有效種群大小、種群的系統發育重建等研究。毋 庸置疑，SSR標記目前已成為居群遺傳學最流行的分子標記，但是，由于SSR標記具有種屬特異性，當所研究的目標物種缺乏前期研究基礎而無法獲得現成的SSR分子標記時，需要對其進行分子標記開發工作。采取實驗室手段開發SSR引物費時，耗力，成本高，試驗復雜，基于現有轉錄組數據庫信息進行SSR引物開發將是一種既經濟又有效的方法。從表達序列標簽(expressed sequence tag, EST)中開發SSR標記(EST-SSR)是近年來發展起來的新型分子標記，與基因組SSR相比，它反映了基因組的編碼區域，可以直接獲得基因表達的信息，有可能對決定重要表型性狀的等位基因進行直接鑒定；充分利用了現有測序數據，降低了開發成本；在不同物種間通用性好，具有較高的轉移性。自2000年起，已相繼水稻、小麥、馬鈴薯、葡萄、核桃、甜瓜等多種植物上開展了 EST-SSR標記開發，并廣泛用于遺傳圖譜構建、遺傳多樣性分析、功能基因定位、比較作圖等研究。美I 崖豆藤(Callerya speciosa Champ.),為豆科蝶形花亞科雞血藤屬多年生藤狀灌木植物，是一種分布于熱帶和亞熱帶地區的野生名貴南藥，具有悠久的藥用歷史，以根入藥(藥材名牛大力)，主治風濕性關節炎、腰肌勞損、慢性支氣管炎、慢性肝炎、遺精、白帶等，廣泛地應用于多種中成藥方劑的配制(《全國中草藥匯編》編寫組，1996)，此外，還可用于熬制靚湯，藥食兼用，具有極大的開發利用價值，是一種重要的經濟藥用植物資源。然而，我國美麗崖豆藤的人工馴化栽培才剛起步，其藥材原料主要依賴野生資源，隨著市場需求的與日俱增，長期的供不應求帶來的掠奪性開發和不合理采挖，已經造成美麗崖豆藤種質資源的極大破壞，廣西、廣東的野生資源已經瀕臨枯竭，海南尚有一定的野生資源，但其蘊藏量也十分有限，多呈斑塊狀零星分布。目前，國內需要的牛大力藥材多從越南進口，但產地國開始采取措施保護本國的生態環境和資源，限制了出口量，這將在很大程度上影響我國對牛大力的用藥需求?？梢妼γ利愲u血藤野生資源的保護已迫在眉睫了，但要制定切實有效的保護計劃，就必須了解野生種群結構和遺傳多樣性等方面的信息?，F有的通用型分子標記，如RAPD、ISSR等，存在重復性差的嚴重缺陷，為顯性標記且存在共遷移缺點；AFLP雖然具有多態性高，重復性好，穩定可靠和選擇中性等優點，但仍為顯性標記且操作難度大。相比而言，SSR操作簡單，客觀明確，選擇中性和呈共顯性的孟德爾式遺傳，能夠鑒別雜合體，對隱性性狀的選擇十分有利，它具有比其它分子標記(如等位酶、RFLP. RAPD等)更多的可檢測等位基因，能夠提供更細致的基因變化分析范圍。但美麗雞血藤的SSR標記尚未見報道。
技術實現思路
本專利技術的目的在于提供一種美麗雞血藤的EST-SSR分子標記，建立美麗雞血藤微衛星的技術體系并利用這套分子標記進行美麗雞血藤的遺傳多樣性研究和親權關系鑒定。為了實現上述目的，本專利技術的技術方案為提供一種美麗雞血藤EST-SSR標記，其特征在于所述的微衛星標記編號為Ndl—001、Ndl—002、Ndl—003、Ndl—004、Ndl—010、Ndl—011、Ndl—013、Ndl—015、Ndl—019、Ndl—020、Ndl—021、Ndl—022、Ndl—028、Ndl—031、Ndl—032、Ndl—033、Ndl—038、Ndl—042、Ndl—043、Ndl—047、Ndl—049、Ndl—050、Ndl—051、Ndl—053 ； 其核苷酸序列分別為Ndl—001 ctcactcgta gccgttccgc tatcctcagc ataagcatct cgacacattc gatctctaga60atcttcttat tatccttctt tatctttcta ctatggcttg ctccaccgtt gtgttgatgc120tagtcgctgc attgttggtg agctccaccg ttgctcaatc tctggcatcg tcgccggctt180cgtctcccac caactcgcct gtggccactc cgccgaagtc ttctcactct ccggcgccgg240tgatttctcc gtccgctagt tcaccggcgg catctcctcc tgctccggtg gagagcggtc300cctctccttc gcctgccgcc gtcaactctc cgccatctcc tcctccggct gcctctgcgt360cgccagctgg cactccttcg gtcactccct cttcgatctc cagtccgcca tctgaagcac420catcaccaag ccaaaacgac gccgctttga acagattcac cgtcgccgga tctgctgctg480ttgtggtttt cgctgcggct ttgctgatgt agagagagag agagagagag agagagacag540agttacttgg agtcaataat tttcttcctt ttttttaatt ctatattcac gaaattatat600ggatcgtgaa cccttgtacc tcatttttgg ttgctcttct cagtgtgacg attcattctt660tcgattattt tctgtattct atttattatt ctatga696Ndl—002 ggaagactcg gagtgattga tggaggcaat gctttcaatc aatttgttgg tgtagagttc60gatagttatg tcaatgggtg ggatccgaat tctgcacata ttggaatcga cgtcaactct120ttgatttcgt tgaagacagt gaaatggaac agggtgagtg ggtcattggt ccaagtgagc180ataatctatg actctctgtc taagacattg agtgttgctg tgactgacaa gaatggtcaa240atttctaccg ttgctcaagt cgttgatttg aaagctgtgc tcccggagaa ggtcaaggtt300ggtctatctg ctgccacatc tt本文檔來自技高網...
【技術保護點】
美麗雞血藤EST？SSR標記，其特征在于：所述的微衛星標記編號為：Ndl_001、Ndl_002、Ndl_003、Ndl_004、Ndl_010、Ndl_011、Ndl_013、Ndl_015、Ndl_019、Ndl_020、Ndl_021、Ndl_022、Ndl_028、Ndl_031、Ndl_032、？Ndl_033、Ndl_038、Ndl_042、Ndl_043、Ndl_047、Ndl_049、Ndl_050、Ndl_051、Ndl_053；其核苷酸序列分別為：Ndl_001：ctcactcgta？gccgttccgc？tatcctcagc？ataagcatct？cgacacattc？gatctctaga？？？？？？？？60atcttcttat？tatccttctt？tatctttcta？ctatggcttg？ctccaccgtt？gtgttgatgc？？？？？？？120tagtcgctgc？attgttggtg？agctccaccg？ttgctcaatc？tctggcatcg？tcgccggctt？？？？？？？180cgtctcccac？caactcgcct？gtggccactc？cgccgaagtc？ttctcactct？ccggcgccgg？？？？？？？240tgatttctcc？gtccgctagt？tcaccggcgg？catctcctcc？tgctccggtg？gagagcggtc？？？？？？？300cctctccttc？gcctgccgcc？gtcaactctc？cgccatctcc？tcctccggct？gcctctgcgt？？？？？？？360cgccagctgg？cactccttcg？gtcactccct？cttcgatctc？cagtccgcca？tctgaagcac？？？？？？？420catcaccaag？ccaaaacgac？gccgctttga？acagattcac？cgtcgccgga？tctgctgctg？？？？？？？480ttgtggtttt？cgctgcggct？ttgctgatgt？agagagagag？agagagagag？agagagacag？？？？？？？540agttacttgg？agtcaataat？tttcttcctt？ttttttaatt？ctatattcac？gaaattatat？？？？？？？600ggatcgtgaa？cccttgtacc？tcatttttgg？ttgctcttct？cagtgtgacg？attcattctt？？？？？？？660tcgattattt？tctgtattct？atttattatt？ctatga？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？696Ndl_002：ggaagactcg？gagtgattga？tggaggcaat？gctttcaatc？aatttgttgg？tgtagagttc？？？？？？？？60gatagttatg？tcaatgggtg？ggatccgaat？tctgcacata？ttggaatcga？cgtcaactct？？？？？？？120ttgatttcgt？tgaagacagt？gaaatggaac？agggtgagtg？ggtcattggt？ccaagtgagc？？？？？？？180ataatctatg？actctctgtc？taagacattg？agtgttgctg？tgactgacaa？gaatggtcaa？？？？？？？240atttctaccg？ttgctcaagt？cgttgatttg？aaagctgtgc？tcccggagaa？ggtcaaggtt？？？？？？？300ggtctatctg？ctgccacatc？ttcgggcggc？cgtcaaagac？acgacatcca？ttcatggtct？？？？？？？360ttcacttcaa？acttggagac？ggctacactc？agcaccgcgg？agaacgcaaa？tattgcaagc？？？？？？？420tatgcatgat？tcctggtccg？tcaaatgtgg？cttgtgataa？ctagtatttc？taaataaagg？？？？？？？480ccatatatct？agtcaatata？tatatatata？tatatgtgtg？tgtgtgtgtt？tgagtccatg？？？？？？？540catgttgctt？aaattttggc？tactcaactt？atgcaaggtg？ggtggttgaa？aatggaatta？？？？？？？6...
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：李麗，李志英，徐立，黃碧蘭，李克烈，
申請(專利權)人：中國熱帶農業科學院熱帶作物品種資源研究所，
類型：發明
國別省市：
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