本發(fā)明專(zhuān)利技術(shù)公開(kāi)了雞柔嫩艾美耳球蟲(chóng)MA1基因、載體、重組菌株和蛋白及其應(yīng)用。EtMA1蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO:2所示，或者是SEQIDNO:2所示的氨基酸序列經(jīng)取代、缺失和/或增加一個(gè)或多個(gè)氨基酸和/或末端修飾且具有同等活性的蛋白。本發(fā)明專(zhuān)利技術(shù)還公開(kāi)了EtMA1膜外功能域蛋白（EtMA1-Outsidedomain），其氨基酸序列如SEQIDNO:4所示，或者是SEQIDNO:4所示的氨基酸序列經(jīng)取代、缺失和/或增加一個(gè)或多個(gè)氨基酸和/或末端修飾且具有同等活性的蛋白。EtMA1蛋白和EtMA1膜外功能域蛋白可應(yīng)用于制備抗艾美耳球蟲(chóng)藥物，通過(guò)免疫EtMA1膜外功能域蛋白，能有效控制雞體感染柔嫩艾美耳球蟲(chóng)病，大大降低養(yǎng)雞場(chǎng)抗球蟲(chóng)藥的使用量，有效控制雞球蟲(chóng)病。
【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專(zhuān)利技術(shù)屬于基因工程
，具體涉及雞柔嫩艾美耳球蟲(chóng)姻2蛋白(位姻7蛋白)的膜外功能域蛋白Wii^i-Outside domain)及其編碼基因、含有該基因的載體、重組菌株及其應(yīng)用；還涉及雞柔嫩艾美耳球蟲(chóng)姻7蛋白及其編碼基因、含有該基因的載體、重組菌株及其應(yīng)用。
技術(shù)介紹
雞球蟲(chóng)病是一種嚴(yán)重危害集約化養(yǎng)雞業(yè)、世界性流行的寄生蟲(chóng)病，在無(wú)預(yù)防措施或預(yù)防失敗(如因抗藥性問(wèn)題致藥物無(wú)效)的情況下，雞發(fā)病率可達(dá)30%-100%，致死率可高 達(dá)80%。全球每年因球蟲(chóng)病引起的經(jīng)濟(jì)損失超過(guò)35億美元以上，我國(guó)因球蟲(chóng)病所致養(yǎng)雞業(yè)的經(jīng)濟(jì)損失估計(jì)可高達(dá)35億元人民幣以上。目前，世界公認(rèn)的雞球蟲(chóng)有7種柔嫩艾美耳球蟲(chóng)(疋te/^77a)，毒害艾美耳球蟲(chóng)(￡· neca trix ),巨型艾美耳球蟲(chóng)(i . maxima )，堆型艾美耳球蟲(chóng)(i . acervulina )，布氏艾美耳球蟲(chóng)iE. brunette),早熟艾美耳球蟲(chóng)iE. praecox),和緩艾美耳球蟲(chóng)(M. mitis),其中柔嫩艾美耳球蟲(chóng)主要侵害盲腸，是毒力最強(qiáng)、危害最大的雞球蟲(chóng)，也是研究最多的蟲(chóng)種。長(zhǎng)久以來(lái)，國(guó)內(nèi)外雞球蟲(chóng)病的預(yù)防一直采用“在飼料中添加抗球蟲(chóng)藥、實(shí)行以飼料廠為中心控制環(huán)節(jié)”的技術(shù)方法，但該方法已遭遇到球蟲(chóng)抗藥性的嚴(yán)峻挑戰(zhàn)，在某些地區(qū)甚至已到無(wú)藥可用的困難境地。免疫控制技術(shù)作為一種“新型的(novel)可持續(xù)的(sustainable) ”的球蟲(chóng)病控制方法已得到越來(lái)越多的應(yīng)用。盡管以雞球蟲(chóng)病活卵囊疫苗為主要技術(shù)載體的免疫控制技術(shù)正在逐步推廣應(yīng)用，但這類(lèi)疫苗完全以雞體作為唯一制苗載體，普遍存在生產(chǎn)成本高、保存運(yùn)輸困難、接種使用后對(duì)雞體生長(zhǎng)有明顯抑制、散毒危險(xiǎn)和難以質(zhì)量控制等幾乎不可逾越的障礙。因此，開(kāi)發(fā)新藥或新型分子疫苗是球蟲(chóng)病研究的主要方向，然而迄今為止，人們對(duì)艾美耳球蟲(chóng)的藥物靶標(biāo)分子或候選疫苗分子都知之甚少。頂膜抗原(Apical Membrane Antigen, ΑΜΑ)是一種在頂復(fù)門(mén)原蟲(chóng)中高度保守的微線分泌蛋白，可以和棒狀體分泌的頸部蛋白共同形成“運(yùn)動(dòng)結(jié)合體(Moving Junction)”,共同完成蟲(chóng)體與宿主細(xì)胞的粘附作用，是協(xié)助蟲(chóng)體進(jìn)入宿主細(xì)胞的關(guān)鍵物質(zhì)。近幾年，通過(guò)對(duì)雞球蟲(chóng)基因文庫(kù)和蛋白質(zhì)組的研究，開(kāi)始對(duì)雞球蟲(chóng)AMAl有所了解，但目前為止未有系統(tǒng)性研究的報(bào)道。Ng等在對(duì)柔嫩艾美耳球蟲(chóng)的子孢子和裂殖子的cDNA文庫(kù)比較研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，子孢子階段有一條EST序列(基因登陸號(hào)BG589)與AMAl具有相似性，而在裂殖子文庫(kù)中未找到相同的EST序列。在Bromley等的蛋白組學(xué)研究中發(fā)現(xiàn)，柔嫩艾美耳球蟲(chóng)不只一種頂膜抗原，并且出現(xiàn)在不同的發(fā)育階段，所以分析可能這些蛋白分別在不同的入侵階段發(fā)揮著類(lèi)似的作用。Blake等利用基因圖譜法對(duì)球蟲(chóng)中免疫力最強(qiáng)的巨型艾美耳球蟲(chóng)保護(hù)性抗原進(jìn)行篩選，將兩株具有不同生物學(xué)特性的巨型艾美耳球蟲(chóng)在雞體內(nèi)進(jìn)行雜交后的基因組，與柔嫩艾美耳球蟲(chóng)的基因組進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與AMAl具有同源性的抗原可以?xún)?yōu)先刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫力，可以?xún)?yōu)先作為疫苗和藥物開(kāi)發(fā)的研究靶標(biāo)。本課題組在對(duì)廣東株柔嫩艾美耳球蟲(chóng)裂殖子cDNA的克隆時(shí)，獲得了多個(gè)類(lèi)似頂膜抗原的基因，其中雞柔嫩艾美耳球蟲(chóng)蛋白(萬(wàn)—2」的氨基酸序列與EtAMAl具有高度保守的序列，推測(cè)為EtAMAl的家族蛋白。在對(duì)其功能進(jìn)行研究時(shí)，發(fā)現(xiàn)免疫蛋白的膜外功能結(jié)構(gòu)域可以有效預(yù)防雞體感染雞球蟲(chóng)病。而迄今為止，尚無(wú)任何其他關(guān)于該蛋白對(duì)艾美耳球蟲(chóng)免疫保護(hù)性的研究。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專(zhuān)利技術(shù)的一個(gè)目的在于提供一種雞柔嫩艾美耳球蟲(chóng)蛋白(MMA1蛋白)。本專(zhuān)利技術(shù)的另一個(gè)目的在于提供編 碼上述萬(wàn)_2蛋白的基因。本專(zhuān)利技術(shù)的目的在于提供一種位姻7膜外功能域蛋白(i ii^7_0utside domain)。本專(zhuān)利技術(shù)的另一個(gè)目的在于提供編碼上述膜外功能域蛋白的基因。本專(zhuān)利技術(shù)的另一個(gè)目的在于提供含有萬(wàn)_2蛋白基因或萬(wàn)_7膜外功能域蛋白基因的克隆載體。本專(zhuān)利技術(shù)的另一個(gè)目的在于提供一種萬(wàn)_2膜外功能域蛋白的制備方法。本專(zhuān)利技術(shù)的另一個(gè)目的在于提供萬(wàn)_2蛋白和/或萬(wàn)_2膜外功能域蛋白在制備抗艾美耳球蟲(chóng)藥物中的應(yīng)用。本專(zhuān)利技術(shù)所采用的技術(shù)方案是 雞柔嫩艾美耳球蟲(chóng)姻7蛋白(扮M7蛋白)，其氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示，或者是SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列經(jīng)取代、缺失和/或增加一個(gè)或多個(gè)氨基酸和/或末端修飾且具有同等活性的蛋白。編碼上述位姻7蛋白的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO : I所示。位姻7膜外功能域蛋白(i ii^7_0utside domain),其氨基酸序列如SEQ ID N0:4所示，或者是SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列經(jīng)取代、缺失和/或增加一個(gè)或多個(gè)氨基酸和/或末端修飾且具有同等活性的蛋白。編碼上述位姻7膜外功能域蛋白的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。一種克隆載體，含有萬(wàn)—2蛋白的編碼基因或萬(wàn)—2膜外功能域蛋白的編碼基因。一種表達(dá)載體，含有萬(wàn)_2蛋白的編碼基因或萬(wàn)膜外功能域蛋白的編碼基因。缺EtMAl膜外功能域蛋白的方法，包括將上述的表達(dá)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞中，表達(dá)得到萬(wàn)_7膜外功能域蛋白。EtMAl蛋白或萬(wàn)_7膜外功能域蛋白在制備抗艾美耳球蟲(chóng)藥物中的應(yīng)用。本專(zhuān)利技術(shù)的有益效果在于 通過(guò)免疫膜外功能域蛋白，能有效控制雞體感染柔嫩艾美耳球蟲(chóng)病，大大降低養(yǎng)雞場(chǎng)抗球蟲(chóng)藥的使用量，有效控制雞球蟲(chóng)病。附圖說(shuō)明圖I是萬(wàn).tenella裂殖子總RNA電泳結(jié)果； 圖2是位姻7基因全長(zhǎng)ORF的PCR擴(kuò)增鑒定結(jié)果(M. DL 2000 Marker ; I.位姻7的PCR產(chǎn)物);圖3是EtMAl的菌液PCR鑒定結(jié)果(M. DL 2000 Marker ；1:位姻7陽(yáng)性菌) 圖4是EtMAl信號(hào)肽切割位點(diǎn)分析 圖5是EtMAl膜外結(jié)構(gòu)域位點(diǎn)分析 圖 6 是位姻7-Outside domain 的 PCR 產(chǎn)物電泳圖(M. DL 2000 Marker ；1,2.EtMAl-Qutside domain 的 PCR 產(chǎn)物)； 圖 7 是位姻7-Outside domain 的菌液 PCR 鑒定電泳圖(E DL 2000 Marker ;5，6.EtMAl-Outside domain 菌液 PCR 結(jié)果)； 圖8是pColdl -EtMAl-Qutside domain的酶切鑒定電泳 圖9是pColdI~5Yi^7-0utside domain表達(dá)產(chǎn)物SDS-PAGE電泳分析圖(Μ.蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；I.未誘導(dǎo)菌液；2.誘導(dǎo)后菌液；3-9.純化的融合蛋白；10. Western blot)。 具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本專(zhuān)利技術(shù)作進(jìn)一步的說(shuō)明，但并不局限于此。以下實(shí)施例中所采用的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)包括PCR擴(kuò)增、質(zhì)粒提取、質(zhì)粒轉(zhuǎn)化、DNA片段連接、酶切、凝膠電泳等都采用常規(guī)的方法，具體可參見(jiàn)《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(第三版)(Sambrook J, Russell Dff, Janssen K, Argentine J.黃培堂等譯，2002,北京科學(xué)出版社)。及《現(xiàn)代分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)》(盧圣棟主編，第2版，北京中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)出版社，1999.) 實(shí)施例I I萬(wàn)基因序本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
雞柔嫩艾美耳球蟲(chóng)MA1蛋白（EtMA1蛋白），其氨基酸序列如SEQ？ID？NO:2所示，或者是SEQ？ID？NO:2所示的氨基酸序列經(jīng)取代、缺失和/或增加一個(gè)或多個(gè)氨基酸和/或末端修飾且具有同等活性的蛋白。
【技術(shù)特征摘要】
【專(zhuān)利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：戚南山，孫銘飛，吳彩艷，廖申權(quán)，呂敏娜，溫烈娜，謝明權(quán)，
申請(qǐng)(專(zhuān)利權(quán))人：廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所，
類(lèi)型：發(fā)明
國(guó)別省市：
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