北京鴨STMN1基因單核苷酸多態(tài)性及其分子標記的檢測方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)公開了北京鴨STMN1基因的單核苷酸多態(tài)性及其檢測方法，其基因單核苷酸多態(tài)性包括：以包含STMN1基因的待測北京鴨全基因組DNA為模板，以引物對P為引物，PCR擴增北京鴨STMN1基因；用限制性內(nèi)切酶EcoRII消化PCR擴增產(chǎn)物之后，再對酶切后的擴增片段進行瓊脂糖凝膠電泳；根據(jù)電泳結(jié)果鑒定北京鴨STMN1基因外顯子4第48位的核苷酸堿基多態(tài)性。本發(fā)明專利技術(shù)是一種在DNA水平上篩查和檢測與北京鴨經(jīng)濟性狀密切相關(guān)的分子遺傳標記，為北京鴨快速選育提供了分子依據(jù)。

【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)屬于分子遺傳學領(lǐng)域，涉及以北京鴨的功能基因的單核苷酸多態(tài)性(SNP)作為分子遺傳標記，特別涉及北京鴨STMNl基因的單核苷酸多態(tài)性及其檢測方法。
技術(shù)介紹
單核苷酸多態(tài)性(SNP)就是指基因組DNA序列中由于單個核苷酸(A/T/C/G)的替換而引起的多態(tài)性。因此，通常所說的SNP包括堿基的替換、插入、缺失以及重復序列拷貝數(shù)的變化。一個SNP表示在基因組某個位點上有一個核苷酸的變化，主要由單個堿基的轉(zhuǎn)換或者顛換所引起；具有轉(zhuǎn)換型變異的SNP約占2/3，其他幾種SNP在相似的水平上。CpG二核苷酸的胞嘧啶是基因組中最易發(fā)生突變的位點，其中大多數(shù)是甲基化的，可自發(fā)地脫 去氨基而形成胸腺嘧啶。在任何已知或未知的基因內(nèi)或附近都可能找到數(shù)量不等的SNP，根據(jù)它們在基因組中分布的位置可分為基因編碼區(qū)SNP(cSNP)、基因周邊SNP(pSNP)和基因間SNP(iSNP)等三類。總的說來，cSNP比較少，因為在外顯子內(nèi)的變異率僅占周圍序列的1/5，但它在遺傳病和育種的研究中卻具重要意義，因此倍受關(guān)注。根據(jù)對遺傳性狀的影響，cSNP又可分為兩種一種是同義cSNP，即SNP所致編碼序列的改變并不影響其所翻譯的蛋白質(zhì)中氨基酸序列，突變堿基與未突變堿基的“含義”相同；另一種是非同義cSNP，即堿基序列的改變將導致編碼氨基酸的改變，從而產(chǎn)生蛋白質(zhì)序列的改變，可能最終影響到蛋白質(zhì)的功能。因此，對編碼區(qū)SNP的非同義突變來說，它們可能對基因功能有直接的重要影響。不僅如此，在群體遺傳研究中,這些SNP作為遺傳標記在群體遺傳和生物進化的研究中也具有重要意義。由于SNP是二等位基因分子標記，所以，理論上在一個二倍體生物群體中，SNP可能是由2個、3個或4個等位基因構(gòu)成，但實際上3個或4個等位基因的SNP很罕見，故SNP通常被簡單地稱為二等位基因分子標記。目前，主要采用幾種不同的路線來發(fā)現(xiàn)SNP :SPDNA序列測定方法、PCR-SSCP與DNA測序結(jié)合法、AS-PCR方法、引物延伸法和寡核苷酸連接反應等。在這些SNP檢測技術(shù)中，DNA序列測定法是最為準確的SNP檢測方法，但是，其檢測費用極其昂貴，且需要有DNA測序儀等大型儀器，同時，在測序過程中需要非常熟練的技術(shù)人員和經(jīng)驗，所以，DNA序列測定法不是一種應用于生產(chǎn)實際的理想SNP檢測方法；當然，利用PCR-SSCP與DNA測序結(jié)合法檢測SNP可以適當降低檢測費用，但是，PCR-SSCP的實驗過程比較長，操作比較繁瑣，且實驗過程中存在假陽性問題，所以，也并非理想的SNP檢測手段;AS-PCR方法作為一種新型的SNP檢測方法，在未來的應用領(lǐng)域中具有非常廣闊的前景，但是，該方法需要設(shè)計特別的引物，且只能針對特定的基因位點，同時，檢測過程中還存在誤檢的概率，因此，目前不具有普遍應用的特點；而引物延伸法和寡核苷酸連接反應技術(shù)檢測SNP位點，需要平板讀數(shù)儀、基因芯片、微球陣列技術(shù)和質(zhì)譜儀等檢測平臺，對于一般的分子實驗室來說可實施性不強。PCR-RFLP方法是一種檢測SNP的有效技術(shù)，在發(fā)現(xiàn)SNP位點后使用限制性內(nèi)切酶進行切割，然后進行瓊脂糖或聚丙烯凝膠電泳分析，就能準確地鑒別SNP位點。PCR-RFLP方法不僅具有DNA測序法的準確性，又克服了其費用昂貴、操作繁瑣、假陽性率高的缺點，而且所檢測的序列位點無特殊性要求。STMNl (Stathmin)基因抑制微管形成，因為其在杏仁體的外側(cè)核(LA)以及將后天恐懼和先天恐懼的刺激信息發(fā)送到外側(cè)核的丘腦和皮層結(jié)構(gòu)中高表達。Brocke等人報導編碼STMNl的基因有兩個影響人類恐懼和焦慮刺激的行為反應的SNP(rsl82455，rs213641)。提高飼料轉(zhuǎn)化率能減少生長所需的飼料數(shù)量，能減少生產(chǎn)費用，也能減少含氮廢料的數(shù)量。在不影響動物成長的前提下，減少RFI能減少飼料喂養(yǎng)量，能減少背部脂肪，能減少費用。因此，研究家禽STMNl基因遺傳變異和分子遺傳特征具有重要理論和實踐意義。關(guān)于動物STMNl基因遺傳變異的研究國內(nèi)外多見于人、鼠等動物，而未見北京鴨STMNl基因遺傳變異或SNP研究的報道。由于目前北京鴨STMNl基因遺傳變異領(lǐng)域的研究 匱乏，使該基因位點的功能研究及該基因遺傳變異與經(jīng)濟性狀關(guān)聯(lián)的研究成為空白。
技術(shù)實現(xiàn)思路
本專利技術(shù)解決的問題在于提供北京鴨STMNl基因單核苷酸多態(tài)性檢測方法及其應用，尋找與北京鴨經(jīng)濟性狀相關(guān)的SNP作為分子標記，加快北京鴨良種繁育速度。本專利技術(shù)的目的在于提供北京鴨STMNl基因的單核苷酸多態(tài)性，該基因單核苷酸多態(tài)性包括北京鴨STMNl基因外顯子4第48位為C或T的單核苷酸多態(tài)性。本專利技術(shù)的還一目的在于提供北京鴨STMNl基因的單核苷酸多態(tài)性的檢測方法，本專利技術(shù)通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)以包含STMNl基因的待測北京鴨全基因組DNA為模板，以引物對P為引物，PCR擴增北京鴨STMNl基因；用限制性內(nèi)切酶Ec0RII消化PCR擴增產(chǎn)物之后，再對酶切后的擴增片段進行瓊脂糖凝膠電泳；根據(jù)電泳結(jié)果鑒定北京鴨STMNl基因外顯子4第48位的單核苷酸多態(tài)性；所述的引物對P為上游引物Pl :GCAGAGGAGAAGCTGACCCAC 21下游引物P2 CATCAACCCAGGAGCGAGTG 20。所述的PCR擴增反應程序為94°C預變性 5min ;94°C變性 30s，54. 6°C退火 30s，72°C延伸 30s，35 個循環(huán)；72°C延伸IOrnin0所述的瓊脂糖凝膠電泳為濃度為2. 5%的瓊脂糖凝膠電泳。所述的根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果，STMNl基因外顯子4第48位的堿基多態(tài)性為CC 型為 3 個片段:10bp、201bp 和 536bp ;CT 型為 5 個片段:10bp、201bp、262bp、274bp 和536bp ;TT型為4個片段IObp、20Ibp、262bp和274bp。由于片段IObp太小，在瓊脂糖凝膠不能觀察到，片段262bp和274bp大小相差太小，在瓊脂糖凝膠上不易分開，形成了 I條帶，所以在瓊脂糖凝膠上，CC基因型可以觀察到2條帶(201bp和536bp)，CT基因型可以觀察到3條帶(201bp、262bp+274bp和 536bp)，TT基因型可以觀察到 2 條帶(201bp和 262bp+274bp)。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本專利技術(shù)具有以下有益的技術(shù)效果本專利技術(shù)公開了與北京鴨生長發(fā)育相關(guān)的功能基因STMNl的核苷酸多態(tài)性，該核苷酸多態(tài)性能夠作為一個分子遺傳標記，利用標記位點信息和數(shù)量性狀的表型信息，更準確估計動物個體的育種值，提高選擇效率，加快育種進展。本 專利技術(shù)對STMNl基因的SNP進行了基因分型和基因頻率分析，結(jié)果顯示STMNl基因的核苷酸多態(tài)位點能夠成為分子遺傳輔助育種的標記。本專利技術(shù)提供的檢測方法為STMNl基因的SNP與經(jīng)濟性狀關(guān)系的建立奠定了基礎(chǔ)，以便用于中國北京鴨標記輔助選擇，快速建立遺傳資源優(yōu)良的北京鴨種群。附圖說明圖I為北京鴨STMNl基因外顯子4的747bp克隆測序PCR產(chǎn)物電泳圖；圖2為北京鴨STMNl基因外顯子4的747bp PCR產(chǎn)物的EcoRII酶切電泳檢測STMNl基因多態(tài)性的電泳結(jié)果圖；泳道I :CT基因型個體(10bp、201bp、262bp、274bp和536bp本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護點】
北京鴨STMN1基因的單核苷酸多態(tài)性，其特征在于，該基因單核苷酸多態(tài)性包括：北京鴨STMN1基因外顯子4第48位為C或T的單核苷酸多態(tài)性。

【技術(shù)特征摘要】

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：陳宏，張海燕，張春雷，房興堂，
申請(專利權(quán))人：江蘇師范大學，
類型：發(fā)明
國別省市：