本發明專利技術提供一種用于檢測布魯氏菌(Brucella)的LAMP引物及含有該引物的試劑盒，所述引物包括2條內引物(FIP、BIP)，2條外引物(F3、B3)和2條環引物（LB、LF）（如Seq?ID?No.1-6所示）。本發明專利技術將LAMP引物恒溫擴增技術用于布魯氏菌病菌的快速檢測，可快速、準確、便捷地檢測出血清標本中的布魯氏菌。該方法的特異性和靈敏度均較常規PCR方法更高，對布魯氏菌的早期預防、病原監測等方面具有重要意義；同時可以免除高昂的儀器投入，更適合用于布魯氏菌病流調現場或基層衛生防疫。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及布魯氏菌的檢測，具體地說，涉及用于檢測布魯氏菌的LAMP引物及含有該引物的試劑盒。
技術介紹
布魯氏菌(Brucella)是一種無芽孢、無鞭毛的對人畜有致病力的革蘭陰性胞內寄生菌，是布魯氏菌病(brucellosis,簡稱布病)的病原體。傳統的布魯氏菌種型包括羊種(3個型)、牛種(8個型)、豬種(5個型)、犬種(I個型)、綿羊附睪種(I個型)及沙林鼠種(I個型)，共6個種19個型。感染人的布魯氏菌種以前三種居多。布病患者有發熱、多汗、肝脾腫大、關節和全身肌肉痛等癥狀；布病因誤診誤治容易轉為慢性期，慢性期布病病程長， 易復發或發生再感染，可導致病人勞動力降低甚至喪失。動物感染后可導致流產、不孕、繁殖成活率下降等。在我國，布病被列為乙類傳染病，羊種、牛種布魯氏菌感染量居多，伴有豬種、犬種菌感染。診斷布病的金標準是分離培養布魯氏菌，然而這種方法風險較大、耗時，陽性率僅為15% 70%。血清學方法雖然是目前國內最普遍的布病檢測方法，但在布魯氏菌感染早期沒有抗體產生時，抗體檢測方法受限，加之存在血清學交叉反應，所以僅靠血清學方法容易出現布病的誤診和漏診。分子生物學方法特別是PCR技術能特異性地檢測到布魯氏菌核酸，而且該方法簡單快速，將該技術用于布魯氏菌的檢測鑒定，可以提高布病臨床診斷的準確性。然而采用常規PCR方法進行布魯氏菌檢測，對儀器設備(如PCR儀、凝膠成像系統)要求高，投入大，給技術的基層推廣造成了極大障礙。
技術實現思路
本專利技術的目的是提供一種便于基層推廣使用的，用于檢測布魯氏菌的LAMP引物及含有該引物的試劑盒。為了實現本專利技術目的，本專利技術的一種用于檢測布魯氏菌(Brucella)的LAMP引物組，其包括外側正向引物F3 :5 ’ -GAACGTGTTGGATTGACCT-3 ’ ；外側反向引物B3 :5’ -TGCTGTTGTCGATGCTATCG-3’ ；及內側正向引物 FIP : 5 ’ -GCAGCCTATGATGCCGATCACTTGATCTGAGCCGTTGCCT-3 ’ ；內側反向引物BIP :5’ -CCACACCCTTCAAGCCGGATAGCCGCTGCGAATAAAGCCAA-3’ ；以及環引物LB :5’ -AAGGCTTGAAGCTTGCGGA-3’ ；環引物LF :5，-CCTTCATTGCCAGCAATCTCA-3，。本專利技術還提供含有上述LAMP引物組的用于檢測布魯氏菌的試劑盒。前述試劑盒中還包括dNTPs、Bst DNA聚合酶、甜菜堿、Mg2+、反應緩沖液中的一種或多種。更優選地，前述試劑盒還包括標準陽性模板。本專利技術進一步提供上述LAMP引物組或試劑盒在檢測布魯氏菌中的應用，包括步驟1)提取樣品中的DNA ;2)以步驟I)中提取的DNA為模板，進行LAMP-PCR擴增反應；3)分析PCR產物，即對上述擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳，根據電泳檢測結果判定樣品中是否含有布魯氏菌。其中，LAMP-PCR反應體系以25 μ I計為模板DNAΙμ IOmMdNTPs2.5μ120μΜ 引物 FIP2μ1_7] 20μΜ 引物 BIP2μ120μΜ 引物 F30.25μΙ20μΜ 引物 Β30.25μ120μΜ 引物 LBI μ!20μΜ 引物 LFΙμ 8U4ilBstDNA 聚合酶ΙμΙ10 X NEB緩沖液2.5μ1IOOmM MgSO4ΙμΙIOOmM甜菜堿ΙμΙ (JdH2O補足至 25μ1;其中，IOXNEB緩沖液的成分為200mM Tris-HClUOOmM KCl、IOOmM (NH4)2SO4'60mM MgSO4 和 l%Tween 20，以水配制。LAMP-PCR反應條件為63°C 50分鐘，80°C 5分鐘，冰上終止反應。用上述引物組對待測樣品DNA進行恒溫擴增，若電泳檢測結果出現梯狀DNA條帶，則該樣品含有布魯氏菌病菌，若沒有擴增出條帶，則該樣品中不含布魯氏菌病菌。本專利技術采用的環介導等溫擴增技術(Loop-mediated isothermalamplification, LAMP),其作為一種新型的核酸擴增方法，擺脫了特殊擴增儀器和繁瑣檢測過程的約束，能在6(T65°C左右利用一種具有鏈置換活性的DNA聚合酶和4 / 6特異性引物(針對目的片段的6 / 8區域)對核酸進行高效擴增。與傳統的PCR技術相比，LAMP技術的特異性和靈敏性都更勝一籌。其原理是6(T65°C是雙鏈DNA復性和延伸的最佳溫度范圍，在65°C左右DNA合成處于一種動態平衡狀態，因此該溫度下有新合成的DNA。LAMP技術依靠4種特異引物和一種活性較高的鏈置換DNA聚合酶(Bst DNA聚合酶)，使鏈置換DNA反應處于一種動態循環中。擴增主要分為兩個階段，一是LAMP反應中起始結構的合成階段，二是后續擴增循環階段。任何引物與雙鏈DNA中的任一條鏈進行堿基互補配對延伸時，另一條鏈就會解離成單鏈。上游內部引物FIP的F2序列首先與模板F2c結合，在鏈置換型DNA聚合酶的作用下向前延伸啟動鏈置換合成。外部引物F3與模板F3c結合并延伸，置換出完整的FIP連接的互補單鏈。FIP上的Flc與此單鏈上的Fl為互補結構。自我堿基配對形成環狀結構。以此鏈為模板。下游引物BIP與B3先后啟動類似于FIP和F3的合成，形成啞鈴狀結構的單鏈。迅速以3’末端的Fl區段為起點.以自身為模板，進行DNA合成延伸形成莖環狀結構，自此完成反應的第一階段。第二階段是擴增循環階段，以莖環狀結構為模板，FIP與莖環的F2c區結合。開始鏈置換合成，解離出的單鏈核酸上也會形成環狀結構。迅速以3’末端的B I區段為起點，以自身為模板。進行DNA合成延伸及鏈置換。形成長短不一的2條新莖環狀結構的DNA，BIP引物上的B2與其雜交。啟動新一輪擴增。且產物DNA長度增加一倍。為增加靈敏性在反應體系中可以另外添加2條環狀引物LF和LB，它們分別與莖環狀結構結合啟動鏈置換合成，反復循環。擴增的最后產物是包括不同數量莖環結構和長度各異DNA的混合物，且產物DNA為擴增靶序列的交替反向重復序列。環介導等溫擴增方法結果判定方法包括①肉眼觀察法核酸大量合成時，從dNTP析出的焦磷酸根離子和反應溶液中的子(Mg2+)結合，生成副產物焦磷酸鎂白色沉淀物。依據此原理，通過肉眼觀察副產物焦磷酸鎂白色沉淀是否產生從而判斷擴增是否發生。②熒光染料法通過肉眼觀察白色沉淀是否產生來判斷擴增是否發生存在一定的視覺誤差，而通過添加熒光染料例如SYBR Green I、溴化乙錠(EB)等進行呈色反應，結果更易判定。例如，SYBR Green I熒光染料特異性的與雙鏈DNA的小溝結合后發出比原來強80(Γ1000倍的熒光。在核酸大量 合成時，SYBR Green I會自動摻入雙鏈DNA中，如果發生擴增反應，反應結束時混合液由橙色變成綠色，并伴有白色沉淀的產生；反之，反應結束時顏色依然保持SYBR Green I的橙色不變。③瓊脂糖凝膠電泳法根據LAMP原理，LAMP反應的最終產物含有若干倍莖長度的莖環結構和類似花椰菜的結構。所以，產物在瓊脂糖凝膠上電泳呈現的不是單一條帶，而是典型的梯狀條帶。④濁度儀檢測利用日本榮研株式會社研制的針對LAMP的實時監控本文檔來自技高網...
【技術保護點】
用于檢測布魯氏菌（Brucella）的LAMP引物組，其特征在于，其包括：外側正向引物F3：5’？GAACGTGTTGGATTGACCT？3’；外側反向引物B3：5’？TGCTGTTGTCGATGCTATCG？3’；及內側正向引物FIP：5’？GCAGCCTATGATGCCGATCACTTGATCTGAGCCGTTGCCT？3’；內側反向引物BIP：5’？CCACACCCTTCAAGCCGGATAGCCGCTGCGAATAAAGCCAA？3’；以及環引物LB：5’？AAGGCTTGAAGCTTGCGGA？3’；環引物LF：5’？CCTTCATTGCCAGCAATCTCA？3’。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：姜海，崔步云，張利，田國忠，樸東日，趙鴻雁，
申請(專利權)人：中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所，
類型：發明
國別省市：
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