本發明專利技術公開了一種運動機能相關基因EPO熒光檢測試劑盒及檢測方法，屬于生物檢測技術領域。該試劑盒包括擴增前試劑和擴增后試劑；所述擴增前試劑包括：PCR緩沖液、MgCl2和dNTPs的反應混合物，Taq酶，超純水，高特異性擴增EPO基因熱點突變的引物混合物；所述擴增后試劑包括：基因分型標準物和內標。本發明專利技術以上述基因為檢測對象，通過PCR擴增，毛細管電泳檢測，與基因分型標準物的對比，即可進行基因分型，篩選出具有特定基因型的個體，為體育選材提供參考。在體育選材方面首次采用了熒光標記技術、毛細管電泳技術實現對運動機能相關基因的高靈敏度特異性檢測，節約了人力物力和時間。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及一種運動機能相關基因EPO熒光檢測試劑盒及檢測方法，屬于生物檢測
技術介紹
隨著人類基因組計劃的完成，后基因組計劃的全面展開，以基因工程為主導的生物技術在體育運動問題領域的應用得到廣泛的關注。基因遺傳工程應用于運動員選材是歷史必然、大勢所趨，它必將從根本上引起運動選材理論和方法的革命。運用遺傳學的理論和方法進行運動選材已經有了初步進展。促紅細胞生成素(EPO)基因作用于紅骨髄造血干細胞，促使干細胞分裂、分化，生成紅細胞的過程稱為“促紅細胞生成”，這是機體產生新生紅細胞的唯一途徑。EPO對人體生理作用是這樣的重要，以至于20年前就把它作為第一個造血因子來克隆用于臨床治療。重組人促紅細胞生成素(EPO)已為人們所熟知。也就是把人體紅細胞生成素基因轉移到動物細胞中，増加了其體內的血紅細胞數量和促紅細胞生成素濃度。EPO能通過增加人的最大攝氧量而增加人的有氧耐力，可見是醫學技術促進了把EPO作為興奮劑用于有氧耐カ型項目。可以大大増加人體血紅細胞的變異基因現在已經找到。人類在低氧環境下產生的適應性生理性變化存在明顯個體差異性。有報道指出，在模擬海抜2800m低氧暴露24h血清促紅細胞生成素濃度變化存在明顯的不同(-41% — 400%)。部分長跑選手進行低氧訓練研究發現，訓練后最大攝氧量(V02max)的變化從-3. 2到18. 7ml/(min · kg)不等。EPO能促進紅細胞釋放進入血液，最終減輕低氧對機體的損傷，因此EPO基因序列多態性可能與不同個體間對低氧適應性具有差異性。針對位于人類EPO基因全序列第3541bp處，在EPO基因3 ‘端增強子上，ー個T/G單核苷酸多態性，即SNP/T3541G的研究表明，在EPO基因T3541G位點的三種基因型TT型、TG型、GG型中，攜帯T等位基因的人群低氧適應能力較GG型更強。目前常用的基因檢測方法有直接測序(direct sequencing, DS)、連接酶檢測反應(ligase detection reaction, LDR)、限制性片段長度多態性分析(restrictionfragment length polymorphism, RFLP)> 變性高效液相色譜分析(denaturing highperformance liquid chromotography,DHPLC)、定量PCR。這些方法都存在不同的缺陷，例如操作繁瑣、結果不易判讀、重復性差、假陰性假陽性多等問題。采用熒光標記技術、毛細管電泳技術，通過帶不同熒光標記物的引物對運動機能相關基因EPO特異性的擴增，而后經毛細管電泳后分析PCR產物出峰情況，即可實現對該運動機能相關基因位點的檢測，靈敏度高、判讀清晰準確、采樣方便。
技術實現思路
本專利技術目的是提供一種運動機能相關基因EPO熒光檢測試劑盒及檢測方法。本專利技術所述的檢測運動機能相關基因EPO熒光檢測試劑盒，包括擴增試劑和擴增后的基因分型用試劑；所述擴增前試劑包括PCR緩沖液、MgCl2, dNTPs的混合物，Taq酶，引物混合物以及超純水；所述擴增后試劑包括內標和用于基因分型的基因分型標準物；使用所述的試劑盒進行PCR擴增反應的條件PCR擴增體系的pH值為8. 0-9. 0，鎂離子濃度為I. 5-3. 5mM，4種dNTP的終濃度各為200-300 μ Μ, Taq酶的用量為O. 1-0. 4U/μ L，引物終濃度為O. 2-0. 4 μ M0用于EPO基因檢測的引物為 SEQ NO. I :5’ -CAT CAG CCG AAG AGA CCA AAG Α-3，；SEQ NO. 2 :5’ -GTAAGCC TAC GCT GGT CAA TAA GGT GG-3’SEQ NO. 3 :5’ -GCC TAC GCT GGT CAA TAA GGT GT-3，；所述的引物中SEQ NO. I的5’端進行熒光染料標記，內標所用的熒光染料為不同的熒光素。所述擴增采用聚合酶鏈式反應來實現，采用多道或單道毛細管電泳進行檢測。采用所述試劑盒應用于運動機能相關基因檢測的方法，是通過熒光引物PCR及毛細管電泳特異性檢測運動機能相關基因EPO ;用于EPO檢測的引物為SEQ NO. USEQ NO. 2、SEQ NO. 3，所述基因的擴增采用聚合酶鏈式反應來實現，采用多道或單道毛細管電泳進行檢測。其中所檢測的人基因組DNA為使用Chelex法、磁珠提取法或酚/氯仿抽提法對來源樣本進行處理得到的DNA ;所述的來源樣本為來源于人類的濾紙片血斑/ 口腔拭子樣本、FTA卡血斑/ 口腔拭子樣本、口腔拭子樣本、血液。使用所述的試劑盒進行PCR擴增時，擴增階段反應在任何型號的PCR儀上進行，擴增程序:94-980C l-5min ;26_32 個循環的 94-98°C 15_60s，55-65 °C 15_60s，72°C 15_60s ；60 °C 30-60min。本專利技術的有益效果如下本專利技術以EPO基因為檢測對象，通過PCR擴增，毛細管電泳檢測，與基因分型標準物的對比，即可進行基因分型，篩選出具有特定基因型的個體，為體育選材提供參考。在體育選材方面首次采用了熒光標記技術、毛細管電泳技術實現對運動機能相關基因的高靈敏度特異性檢測，節約了人力物力和時間。附圖說明圖I是本專利技術的試劑盒對71-2號樣本EPO基因DNA擴增后的分型結果圖；圖2是本專利技術的試劑盒對73-4號樣本EPO基因DNA擴增后的分型結果圖；圖3是本專利技術的試劑盒對83號樣本EPO基因DNA擴增后的分型結果圖。具體實施例方式以下結合實施例對本專利技術做進ー步描述。實施例I本專利技術的試劑盒檢測40個不同個體的DNA樣本。用于運動機能相關基因檢測的引物采用藍色熒光染料標記，內標采用紅色熒光染料標記。I、待測樣本40份，下文列舉的是不同基因型個體3份的結果。相關樣本都已經使用“DNA提取-PCR擴增-測序”的技術方法對EPO進行過測序檢測。其中，71_2號、73_4號、83號樣本的分型結果依次為T/G、T/T、G/G。2、檢材的基因組DNA提取Chelex提取法剪下I 3mm血斑置于I. 5mL離心管中，加入SdH2OlmL,振蕩離心，棄上清液，重復步驟兩次，棄上清液，將5%Chelex-100震蕩懸浮后快速用剪掉的槍頭吸取200 μ L加入離心管中，振蕩數秒，。于56°C水浴保溫30min后，振蕩數秒。95°C沸水浴IOmin,輕微振蕩數秒。2000rpm離心5min,上清中為提取的DNA。3、擴增和擴增產物的檢測分析3. IPCR 擴增體系權利要求1.一種運動機能相關基因EPO熒光檢測試劑盒，其特征在于包括DNA聚合酶及其緩沖溶液、擴增各基因的引物、內標及基因分型標準物。2.根據權利要求I所述的試劑盒，其特征在于 用于EPO基因檢測的引物為SEQ NO. I :5’ -CAT CAG CCG AAG AGA CCA AAG A-3’SEQ NO. 2 :5’ -GTAAGCC TAC GCT GGT CAA TAA GGT GG-3’SEQ NO. 3 :5’ -GCC TAC GCT GGT CAA TAA GGT GT-3’。3.根據權利要求I或2所述的試劑盒，其特征在于所本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種運動機能相關基因EPO熒光檢測試劑盒，其特征在于包括DNA聚合酶及其緩沖溶液、擴增各基因的引物、內標及基因分型標準物。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：步迅，夏子芳，
申請(專利權)人：山東百福基因科技有限公司，步迅，夏子芳，田雪文，張全芳，
類型：發明
國別省市：
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