本發明專利技術涉及一種蜂蜜中主要轉基因蜜源植物花粉鑒定的形態學方法。該方法包括如下操作步驟：（1）蜂蜜樣品中花粉的分離；（2）制作花粉樣品顯微觀察玻片；（3）花粉粒徑測量；（4）花粉標準圖譜的攝制；（5）蜜源植物的判別；本發明專利技術通過對棉花和油菜花粉顯微形態的研究，建立標準花粉圖譜，以顯微鏡檢的方式快速排除不含上述作物花粉的蜂蜜，可用于快速甄別蜂蜜中是否還有轉基因成分。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于蜂蜜中轉基因成分檢測
，具體涉及。
技術介紹
食品安全歷來是各國政府、媒體、消費者所共同關注的敏感問題。針對轉基因食品安全性的爭論從始至今從未停息，也沒有任何公認結論。蜂蜜因含有蜜源植物花粉而成為與轉基因植物相關的特殊產品。蜂蜜中花粉主要來源于蜂群采集，另外一些蜂農為使蜂蜜具有了不同的香型和風味人為地添加。如果這些花粉來自轉基因作物，則蜂蜜中可能含有轉基因成分。蜂蜜是我國傳統大宗出口農副產品，產量、出口量始終穩居于世界各國前列。歐 盟、日韓等國是我國蜂蜜重要的出口市場，對轉基因產品的限制政策，可能成為繼抗生素殘留、農藥殘留問題后新的技術壁壘。本項研究以油菜蜜、棉花蜜為研究對象開展蜂蜜中轉基因成分快速檢測研究，正是為突破發達國家可能設置的新的技術壁壘作好技術上的應對準備；另一方面，近年來市場上產自美國、阿根廷、巴西等國的進口蜂蜜也越來越常見，這些國家是主要的轉基因作物種植區。我們也可以設置相關技術壁壘，以保護我國的經濟利益和消費者權益。
技術實現思路
本專利技術的目的建立起轉基因棉花和油菜花粉的典型特征圖譜，通過鏡檢可以快速簡便地初步判斷蜂蜜中含有轉基因作物花粉的可能性，也可以用于蜂蜜品種判斷，特別是做出是否含有棉花蜜、油菜蜜的初步判斷。本專利技術的目的是這樣實現的，所述的，依序包括如下步驟 (I)采用負壓抽濾法和離心法分離蜂蜜樣品中的花粉； a)負壓抽濾法分離花粉將蜂蜜樣品稀釋后負壓抽濾后，用蒸餾水沖洗濾膜以除去糖分。將濾膜置于50mL離心管中，加入5mL蒸餾水在漩渦振蕩器上激烈振蕩I分鐘，取出濾膜。3000 rpm離心30min,棄上清液，留0. 5mL備用； b)離心法抽提花粉將蜂蜜樣品稀釋、離心后，棄去上清液，加適量蒸餾水重新震蕩懸浮，再次離心30分鐘，棄去上清液，如此重復兩次。最后剩下0. 5mL花粉溶液備用。(2)制作花粉樣品顯微觀察玻片 a)油膠的制備稱取動物明膠Ig置于50mL小燒杯中,加入6 mL蒸懼水浸泡2小時，待其溶化后加入7mL甘油，加熱并輕輕攪拌，盡量少產生氣泡，至完全均勻后冷卻備用； b)乙酸酐硫酸混合液的配置將27mL乙酸酐置于50mL小燒杯中，攪拌中緩緩加入3mL濃硫酸,攪拌均勻備用； c)G.Erdtman乙酸酐分解法將制備好的花粉先用2mL乙酸浸泡l_2h, 3000rpm離心IOmin,棄去乙酸,再加入乙酸酐硫酸(9 1)混合液5mL,水浴煮沸2_3分鐘，3000rpm離心10分鐘，棄上層溶液；加入5mL蒸懼水振蕩使花粉重新懸浮,3000rpm離心IOmin,棄上層溶液。重復兩次，剩下少量處理后花粉溶液備用； d)制片方法將一小滴熱水浴溶化的甘油膠滴在預先烤熱的載玻片上，用移液器移取IOuL花粉溶液或經乙酸酐分解后的花粉溶液，小心滴在甘油膠上，然后將蓋玻片在酒精燈上烤熱后迅速蓋上。要求400倍顯微鏡下每個視野4-8個花粉為宜。待甘油膠冷凝后用加拿大樹膠封邊,可制成永久片。(3)花粉的測量 使用經過校準的目鏡測微尺的Leica DMLS型光學顯微鏡測量自然狀態下的花粉和經過乙酸酐分解法除去原生質的花粉，每種花粉分別測定30個隨機樣本求平均值。( 4 )標準圖譜的攝制 拍攝棉花和油菜花粉的標準圖譜。 (5)蜜源植物判別 在400倍顯微鏡下觀察已制好的花粉片，連續選擇不少于40個不同視野，觀察記錄占主要比例的1-5種花粉，總花粉數在150-300之間較為適宜。所述的蜂蜜樣品如有結晶，應先在40°C水浴中完全融化。所述的負壓抽濾法分離花粉，樣品稀釋比例為I :10 ;離心法抽提花粉樣品稀釋比例為I : 10后，離心轉速為3000 rpm，時間為30分鐘。所述的乙酸酐硫酸混合液的配置比例為9:1。所述的花粉的測量使用的是經過校準的目鏡測微尺的Leica DMLS型光學顯微鏡，分別測量自然狀態下的花粉和經過乙酸酐分解法除去原生質的花粉，每種花粉取隨機30個重復求平均值。所述的標準圖譜的制作使用的是Leica DMLS型光學顯微鏡500萬像素數碼相機和KEYENCE公司VHX-600E 5400萬像素3CXD超景深三維顯微系統，分別拍攝棉花和油菜花粉。所述的蜜源植物花粉的觀察選用放大400倍的顯微鏡下進行，連續選擇不少于40個不同視野。所述的檢樣中分離的花粉，對照建立的標準圖譜，未發現典型或疑似棉花、油菜花粉，可直接判定蜂蜜不含轉基因成分或不含棉花、油菜蜜；如果鏡檢發現存在典型或疑似棉花、油菜花粉，則需進一步確定。附圖說明圖I棉花自然形態花粉三維圖像。圖2棉花自然形態花粉圖像。圖3乙酸酐分解后棉花花粉形態。圖4棉花花粉細網狀紋理。圖5普通顯微鏡下棉花花粉圖像(具圓形散孔，無孔蓋)。圖6自然油菜花粉形態。圖I粗網狀雕紋。圖8乙酸酐分解后油菜花粉形態圖。圖9普通顯微鏡下油菜花粉圖像。圖10南瓜花粉(I)和乙酸酐分解后花粉(2、3)的顯微照片(加厚凸起的孔蓋)。圖11西葫蘆花粉(1、2)和乙酸酐分解后花粉(3)的顯微照片(加厚凸起的孔蓋)。圖12洋槐花粉及局部放大的顆粒狀雕紋。圖13鴨腳木花粉(2)和乙酸酐分解后花粉(I、3)的顯微照片。圖14苕條花粉(I)和乙酸酐分解后花粉(2、3)的顯微照片。圖15蘋果花粉[(1、2)和乙酸酐分解后花粉(3)的顯微照片。 圖16中國李花粉[(1)和乙酸酐分解后花粉(2、3)的顯微照片。具體實施例方式下面結合實施例，對本專利技術作進一步地說明。I.材料與儀器 I.I材料 棉花蜜樣品來自池州高嶺鄉駐架村采樣點；油菜蜜樣品來自廬江縣劉守鄉等采樣點； 1.2儀器 MILLIPORE MILLIFLEX PLUS過濾系統；臺式高速冷凍離心機(BECKMAN 64R)； KEYENCE公司VHX-600E 5400萬像素3CCD超景深三維顯微系統；Leica DMLS型光學顯微鏡。2.方法 2.I花粉的分離(如有結晶應先在40°C水浴中完全融化)； 2. I. I負壓抽濾法分離花粉 將樣品I :10稀釋后負壓抽濾后，用蒸餾水沖洗濾膜以除去糖分。將濾膜置于50mL離心管中，加入5mL蒸餾水在漩渦振蕩器上激烈振蕩I分鐘，取出濾膜。3000 rpm離心30min,棄上清液，留0. 5mL備用； 2. I. 2離心法抽提花粉 將樣品I :10稀釋后，3000 rpm離心30分鐘，棄去上清液，加適量蒸餾水重新震蕩懸浮，再次離心30分鐘，棄去上清液，如此重復兩次。最后剩下0. 5mL花粉溶液備用； 2. 2制片 2. 2. I油膠的制備稱取動物明膠Ig置于50 mL小燒杯中,加入6 mL蒸懼水浸泡2小時,待其溶化后加入7mL甘油，加熱并輕輕攪拌，盡量少產生氣泡，至完全均勻后冷卻備用； 2.2. 2乙酸酐硫酸(9 1)混合液的配置將27mL乙酸酐置于50 mL小燒杯中，攪拌中緩緩加入3mL濃硫酸，攪拌均勻備用； 2.2. 3 G. Erdtman乙酸酐分解法 將制備好的花粉先用2mL乙酸浸泡l-2h, 3000rpm離心IOmin,棄去乙酸,再加入乙酸酐硫酸(9 I)混合液5mL，水浴煮沸2-3分鐘，3000rpm離心10分鐘，棄上層溶液；加入5mL蒸餾水振蕩使花粉重新懸浮，3000rpm離心本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種鑒定蜂蜜中主要轉基因蜜源植物花粉的形態學方法，依序包括如下步驟：？？？（1）采用負壓抽濾法和離心法分離蜂蜜樣品中的花粉：a)負壓抽濾法分離花粉:將蜂蜜樣品稀釋后負壓抽濾后，用蒸餾水沖洗濾膜以除去糖分；將濾膜置于50mL離心管中，加入5mL蒸餾水在漩渦振蕩器上激烈振蕩1分鐘，取出濾膜；3000？rpm離心30min，棄上清液，留0.5mL備用；b)離心法抽提花粉:將蜂蜜樣品稀釋、離心后，棄去上清液，加適量蒸餾水重新震蕩懸浮，再次離心30分鐘，棄去上清液，如此重復兩次；最后剩下0.5mL花粉溶液備用；？？？（2）制作花粉樣品顯微觀察玻片：a)油膠的制備：稱取動物明膠1g置于50？mL小燒杯中，加入6？mL蒸餾水浸泡2小時，待其溶化后加入7mL甘油，加熱并輕輕攪拌，盡量少產生氣泡,至完全均勻后冷卻備用；b)乙酸酐：硫酸混合液的配置：將27mL乙酸酐置于50？mL小燒杯中，攪拌中緩緩加入3mL濃硫酸，攪拌均勻備用；c)G.Erdtman乙酸酐分解法：將制備好的花粉先用2mL乙酸浸泡1？2h，3000rpm離心10min，棄去乙酸，再加入乙酸酐：硫酸（9：1）混合液5mL，水浴煮沸2？3分鐘，3000rpm離心10分鐘，棄上層溶液；加入5mL蒸餾水振蕩使花粉重新懸浮，3000rpm離心10min，棄上層溶液；重復兩次，剩下少量處理后花粉溶液備用；d)制片方法：將一小滴熱水浴溶化的甘油膠滴在預先烤熱的載玻片上，用移液器移取10μL花粉溶液或經乙酸酐分解后的花粉溶液，小心滴在甘油膠上，然后將蓋玻片在酒精燈上烤熱后迅速蓋上；要求400倍顯微鏡下每個視野4？8個花粉為宜；待甘油膠冷凝后用加拿大樹膠封邊，可制成永久片；？？？（3）花粉的測量：使用經過校準的目鏡測微尺的Leica？DMLS型光學顯微鏡測量自然狀態下的花粉和經過乙酸酐分解法除去原生質的花粉，每種花粉分別測定30個隨機樣本求平均值；？？？（4）標準圖譜的攝制：拍攝棉花和油菜花粉的標準圖譜；？？？（5）蜜源植物判別：在400倍顯微鏡下觀察已制好的花粉片，連續選擇不少于40個不同視野，觀察記錄占主要比例的1？5種花粉，總花粉數在150？300之間較為適宜。...
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：余曉峰，鄭海松，祝長青，張霞，姚劍，孫娟娟，宗凱，
申請(專利權)人：安徽出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心，江蘇出入境檢驗檢疫局動植物與食品檢測中心，天津出入境檢驗檢疫局動植物與食品檢測中心，
類型：發明
國別省市：
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