本發(fā)明專利技術(shù)公開了一種梅毒螺旋體IgM抗體膠體金法檢測試劑及其制備方法，該試劑包括金結(jié)合物墊（3）、硝酸纖維素反應(yīng)膜（4）、樣品墊（2）、吸水紙（5）和PVC背襯（1）；將樣品墊、金結(jié)合物墊、硝酸纖維素反應(yīng)膜和吸水紙順次相互疊壓粘附于PVC背襯上；樣品墊疊壓金結(jié)合物墊2-3mm，金結(jié)合物墊疊壓硝酸纖維素反應(yīng)膜2-3mm，吸水紙疊壓硝酸纖維素反應(yīng)膜2-3mm；金結(jié)合物墊上包被了抗人IgM單克隆抗體-膠體金的結(jié)合物，硝酸纖維素反應(yīng)膜質(zhì)控區(qū)（7）和檢測區(qū)（6）位置上分別包被了羊抗鼠IgG抗體或兔抗鼠IgG抗體和特異性的基因重組梅毒螺旋體抗原。本發(fā)明專利技術(shù)產(chǎn)品的生產(chǎn)過程簡單易控制；用于檢測時操作簡便、快速，25分鐘即可判讀結(jié)果，且結(jié)果不受IgG抗體的影響，準確可靠。
【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)屬于醫(yī)學檢驗領(lǐng)域，特別是涉及一種用膠體金免疫層析法檢測梅毒螺旋體IgM抗體的試劑及其制備方法。
技術(shù)介紹
梅毒是由梅毒螺旋體(Treponema pallidum, TP)感染引起的慢性疾病,是性病中危害性比較嚴重的疾病，可通過性、血液和母嬰途徑傳播。梅毒螺旋體危害心血管系統(tǒng)，可導(dǎo)致主動脈炎、主動脈瓣閉鎖不全、主動脈瘤等，也可損害骨骼系統(tǒng)，引起組織和器官破壞，功能喪失，導(dǎo)致殘疾或死亡；通過胎盤傳染胎兒后，可導(dǎo)致自發(fā)性流產(chǎn)、死產(chǎn)或先天梅毒等，母孕早期感染者胎兒40% -50%感染，常常導(dǎo)致死胎、死產(chǎn)、流產(chǎn)、早產(chǎn)或胎兒生長受 限。因此，梅毒在性傳播疾病中其危害性和致死率僅次于艾滋病，它還可垂直傳播，嚴重影響嬰幼兒健康，已成為一大嚴峻的社會公共衛(wèi)生問題。血清學檢測是目前診斷梅毒的重要實驗室檢測方法。目前梅毒的血清學檢測方法主要有兩種一類是非梅毒螺旋體抗原血清試驗，如快速血漿反應(yīng)素環(huán)狀卡片試驗、甲苯胺紅不加熱血清試驗等，常用作梅毒的篩查試驗。由于此類試驗受多種因素影響，常出現(xiàn)生物學假陽性和假陰性結(jié)果，對一、三期梅毒的陽性檢出率不高，僅適用于二期梅毒的診斷。另一類是梅毒螺旋體抗原血清實驗，如梅毒螺旋體血球凝集試驗、明膠凝集試驗、熒光密螺旋體抗體吸收試驗及酶聯(lián)免疫吸附試驗等，這類試驗的敏感性高、特異性強，臨床常用來作為梅毒的確認試驗。但是此類試驗檢測的是梅毒螺旋體IgG抗體和IgM抗體，而IgG抗體長期存在，血清反應(yīng)持續(xù)存在陽性，且可以通過胎盤，被動免疫胎兒，且可持續(xù)多年甚至終生；因而不能區(qū)分新生兒血清抗體反應(yīng)是否來自母親還是胎兒本身，也不能用作梅毒治療的療效觀察。梅毒感染后，IgM抗體是機體最先出現(xiàn)的體液免疫應(yīng)答，一般感染2周即可從血清中檢出，并且只要有活的梅毒螺旋體存在，IgM抗體就會維持在一定的水平。有報道稱IgM抗體100%轉(zhuǎn)陰，在一期梅毒為3個月、二期梅毒為9個月、早期隱性梅毒為2年。因此，TP-IgM可以看作是梅毒早期感染并活動的一項血清學標志。IgM抗體檢測在國外早已被推薦作為早期先天性梅毒的確證試驗，而目前國內(nèi)雖然有少量對早期梅毒的診斷、梅毒的確認及療效監(jiān)控方法的研究，但需先分離IgG抗體，以防止IgG與IgM抗體競爭特異性抗原結(jié)合位點，導(dǎo)致IgM抗體的假陰性。由于對IgG抗體、IgM抗體分離技術(shù)尚沒有完全掌握，沒有形成商品化產(chǎn)品，臨床所用相關(guān)試劑盒基本上為進口，給病人和社會帶來較大的經(jīng)濟負擔，不便于對梅毒的早期診斷、確認和控制。使用膠體金作為示蹤物的膠體金免疫層析法檢測梅毒螺旋體IgM抗體未見相應(yīng)的商業(yè)化試劑，該方法操作簡便、快速、穩(wěn)定性好，易于進行單份樣本檢測，且不需特殊儀器進行檢測，由于示蹤物為固相易于保存、穩(wěn)定性好。
技術(shù)實現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的是為了克服當前檢測梅毒螺旋體IgM抗體技術(shù)在推廣使用中存在的需預(yù)先進行IgG和IgM抗體分離的缺陷，提供一種操作簡便、不需要特定儀器設(shè)備輔助、不需要對檢測人員進行特殊培訓(xùn)的快速檢測試劑并且有效降低檢測成本，同時提供該試劑的制備方法。本專利技術(shù)為解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為一種梅毒螺旋體IgM抗體膠體金法檢測試劑，該試劑包括金結(jié)合物墊(3)、硝酸纖維素反應(yīng)膜(4)、樣品墊(2)、吸水紙(5)和PVC背襯(I);將樣品墊、金結(jié)合物墊、硝酸纖維素反應(yīng)膜和吸水紙順次相互疊壓粘附于PVC背襯上；樣品墊疊壓金結(jié)合物墊2-3mm，金結(jié)合物墊疊壓硝酸纖維素反應(yīng)膜2_3mm，吸水紙疊壓硝酸纖維素反應(yīng)膜2-3mm ;金結(jié)合物墊上包被了抗人IgM單克隆抗體-膠體金的結(jié)合物，硝酸纖維素反應(yīng)膜質(zhì)控區(qū)(7)和檢測區(qū)(6)位置上分別包被了羊抗鼠IgG抗體或兔抗鼠IgG抗體和特異性的基因重組梅毒螺旋體抗原。 所述的樣品墊是包被了葡萄球菌A蛋白(SPA)的玻璃纖維素膜或聚酯纖維素膜。所述檢測區(qū)包被的梅毒螺旋體抗原為純化的特異性基因重組抗原。該試劑的制備方法包括以下步驟 A :制備抗人IgM單克隆抗體取多份正常人血清，混合，經(jīng)透析、離心、純化制得純度達95%的IgM抗體，以人IgM作為抗原，經(jīng)脾內(nèi)注射免疫6-8周齡雌性BALB/c小鼠，取小鼠的免疫脾細胞與骨髓瘤細胞融合，選擇性培養(yǎng)、篩選及克隆化獲得雜交瘤細胞，將雜交瘤細胞接種于BALB/c小鼠腹腔制備腹水，以親和層析法提純鼠抗人IgM單克隆抗體； B :制備多克隆抗體以步驟A所制備的鼠抗人IgM單克隆抗體免疫山羊或兔，取血清純化后提取到羊抗小鼠IgG多克隆抗體或兔抗小鼠IgG多克隆抗體； C :制備膠體金采用檸檬酸三鈉還原法制得粒徑20 40nm的膠體金顆粒； D :制備鼠抗人IgM單克隆抗體-膠體金結(jié)合物用O. IM碳酸鉀調(diào)節(jié)膠體金溶液pH值至最佳標記pH值,按照O. 010 O. 030 mg蛋白/mL膠體金的比例加入鼠抗人IgM單克隆抗體，混勻靜置，高速離心，棄上清，所得沉淀以十分之一初始膠體金體積的金結(jié)合物保存液溶解，制得鼠抗人IgM單克隆抗體-膠體金結(jié)合物；其中，金結(jié)合物保存液為含2 5%的牛血清白蛋白的pH值為8. O 8. 2的O. 01 O. 02M Tris-HCl緩沖液，并含I 4%的蔗糖、O. 5% 1%的酪蛋白鈉、I 2%的Tween-20和萬分之五的疊氮鈉； E :制備樣品墊將葡萄球菌A蛋白(SPA)以稀釋液稀釋至O. 5mg 2 mg/mL，均勻噴涂在玻璃纖維素膜或聚酯纖維素膜上，充分干燥，其中，稀釋液為含I 2%海藻糖的pH值為7.2 7. 6的O. 02 O. 05M PBS溶液，并含I 2%的牛血清白蛋白； F :制備金結(jié)合物墊將步驟D所制備的鼠抗人IgM單克隆抗體-膠體金結(jié)合物均勻包被到玻璃纖維膜上，充分干燥； G :制備硝酸纖維素膜反應(yīng)膜將羊抗小鼠IgG多克隆抗體或兔抗小鼠IgG多克隆抗體和重組梅毒螺旋體抗原分別包被在硝酸纖維素膜的質(zhì)控區(qū)和檢測區(qū)位置，充分干燥； H :將樣品墊、金結(jié)合物墊、硝酸纖維素反應(yīng)膜和吸水紙順次相互疊壓粘附于PVC背襯上；樣品墊疊壓金結(jié)合物墊2-3_，金結(jié)合物墊疊壓硝酸纖維素反應(yīng)膜2-3_，吸水紙疊壓硝酸纖維素反應(yīng)膜2-3_ ;得到試紙板，將試紙板按照需求切割成不同寬度的試紙條。本專利技術(shù)的效果在于 (1)生產(chǎn)過程簡單易控制； (2)檢測速度快，在25分鐘內(nèi)即可得到檢測結(jié)果，且不需要專業(yè)培訓(xùn)只要按照說明書操作即可實現(xiàn)自我檢測； (3)由于在樣品墊上加入了IgG抗體處理系統(tǒng)，采用固相結(jié)合方法捕獲樣本中的IgG抗體，從而不需要在檢測前對血清進行分離去除IgG抗體的處理，檢測的靈敏度高、特異性好，結(jié)果準確可靠； (4 )可進行單人份檢測，且產(chǎn)品穩(wěn)定性好，不需特殊儲存條件(常溫保存)。 附圖說明圖I為本專利技術(shù)試劑的結(jié)構(gòu)示意圖。具體實施例方式(I)取3 5份正常人血清，混合，經(jīng)冷雙蒸水(4°C)透析，離心取沉淀，過AcA3柱純化得到純度達95%的IgM抗體；以所提取、純化的人IgM作為抗原，經(jīng)脾內(nèi)注射免疫6-8周齡雌性BALB/c小鼠；取小鼠的免疫脾細胞與骨髓瘤細胞融合，選擇性培養(yǎng)、篩選及克隆化獲得分泌抗人IgM單克隆抗體的雜交瘤細胞；將分泌抗IgM的雜交瘤細胞接種于BALB/c小鼠腹腔制備腹水，以親和層析法提純鼠抗人IgM單克隆抗體； (2)本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護點】
一種梅毒螺旋體IgM抗體膠體金法檢測試劑，其特征在于該試劑包括金結(jié)合物墊（3）、硝酸纖維素反應(yīng)膜（4）、樣品墊（2）、吸水紙（5）和PVC背襯（1）；將樣品墊、金結(jié)合物墊、硝酸纖維素反應(yīng)膜和吸水紙順次相互疊壓粘附于PVC背襯上；樣品墊疊壓金結(jié)合物墊2？3mm，金結(jié)合物墊疊壓硝酸纖維素反應(yīng)膜2？3mm，吸水紙疊壓硝酸纖維素反應(yīng)膜2？3mm；金結(jié)合物墊上包被了抗人IgM單克隆抗體？膠體金的結(jié)合物，硝酸纖維素反應(yīng)膜質(zhì)控區(qū)（7）和檢測區(qū)（6）位置上分別包被了羊抗鼠IgG抗體或兔抗鼠IgG抗體和特異性的基因重組梅毒螺旋體抗原。
【技術(shù)特征摘要】
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：呂傳臣，周逸，
申請(專利權(quán))人：北京新興四寰生物技術(shù)有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：
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