本發明專利技術提供了使用基于序列的分析和合理的策略來修飾且改善免疫結合劑，特別是單鏈抗體（scFv）的結構和生物物理學性質（包括性質如穩定性、溶解性和/或抗原結合親和力）的方法。本發明專利技術提供了通過在經由分析所選擇的穩定scFv序列的數據庫鑒定的氨基酸位置處進行一個或多個置換而改造免疫結合劑，特別是scFv的方法，其中用于置換的優選氨基酸殘基已得到鑒定。本發明專利技術還提供了根據本發明專利技術的改造方法制備的免疫結合劑。本發明專利技術還提供了CDR序列可以插入其內的優選的scFv構架支架，以及使用這些優選的構架支架制備的scFv抗體。
【技術實現步驟摘要】
修飾抗體的方法和具有改善的功能性質的修飾抗體本申請是申請日為2008年6月25日、專利技術名稱為“修飾抗體的方法和具有改善的功能性質的修飾抗體”、申請號為200880021889. 4的申請的分案申請。本申請要求于2007年6月25日提交的美國臨時申請序列號60/937，112的優先權，所述美國臨時申請的名稱為 “Sequence Based Engineering and Optimization ofSingle Chain Antibodies”。本申請還要求于2008年3月12日提交的美國臨時申請序列號61/069，056的優先權,所述美國臨時申請的名稱為“Methods of Modifying Antibodies,and Modified Antibodies with Improved Functional Properties，，。專利技術背景 已證明抗體在癌癥、自身免疫疾病和其他病癥的治療中是非常有效和成功的治療齊U。盡管一般已在臨床上使用全長抗體，但存在使用抗體片段可以提供的許多優點，例如增加組織穿透力、與增加其他效應子功能的能力結合的Fe效應子功能的不存在、和由較短的全身體內半衰期導致的較少全身性副作用的可能性。抗體片段的藥代動力學性質表明，它們可能特別良好地適合于局部治療方法。此外，抗體片段在特定表達系統中可以比全長抗體更容易產生。一個類型的抗體片段是單鏈抗體(scFv)，其由經由接頭序列綴合的輕鏈可變結構域(')與重鏈可變結構域(Vh)組成。因此，scFv缺乏所有抗體恒定區結構域，并且先前的可變/恒定結構域界面的氨基酸殘基(界面殘基)變成溶劑暴露的。scFv可以通過已建立的重組改造技術由全長抗體(例如IgG分子)制備。然而，全長抗體轉變成scFv通常導致蛋白質的弱穩定性和溶解性、低產量和高聚集趨勢，這增加免疫原性危險。因此，已嘗試改善scFv的性質例如溶解性和穩定性。例如,Nieba,L.等人(Prot.Eng. (1997) 10 =435-444)選擇已知為界面殘基的3個氨基酸殘基且使其突變。他們觀察到突變的scFv在細菌中周質表達增加，以及熱誘導聚集速率減小，盡管熱力學穩定性和溶解性未顯著改變。其中對scFv內的特定氨基酸殘基執行定點誘變的其他研究也已得到報告(參見例如，Tan，P. H.等人(1988) Biophys. J. 75 1473-1482 ；WftriIjA.和 Pluckthun,A. (1998) Biochem. 37 13120-13127 ； Worn, A.和 Pliickthun，A. (1999) Biochem. 38 8739-8750)。在這些各種研究中，選擇用于誘變的氨基酸殘基基于其在scFv結構內的已知位置(例如，來自分子建模研究)進行選擇。在另一種方法中，將來自表達極弱的scFv的互補決定區(⑶R)移植到已證實具有有利性質的 scFv 的構架區內(Jung, S.和 Pliickthun, A. (1997) Prot. Eng. 10 :959_966)。所得到的scFv顯示改善的可溶性表達和熱力學穩定性。改造scFv以改善功能性質中的進展在例如'Viini , Α.和Pliickthun，A. (2001)J. Mol. Biol. 305 :989-1010中綜述。然而，仍需要允許合理設計具有優良功能性質的scFv的新方法，特別是幫助技術人員選擇潛在有問題的氨基酸殘基用于改造的方法。此外，仍需要改造scFv和其他類型抗體從而賦予改善的功能性質，例如增加的穩定性和/或溶解性性質的方法。專利技術概述本專利技術提供了基于穩定、可溶SCFv構架的序列分析改造免疫結合劑例如SCFv抗體的方法，所述序列分析允許鑒定在scFv序列內對于穩定性和/或溶解性潛在有問題的氨基酸和鑒定在此種氨基酸位置處優選的氨基酸殘基置換。因此，依照本專利技術的方法鑒定的氨基酸殘基可以選擇用于突變，并且可以制備已突變的改造的免疫結合劑例如scFv，且就改善的功能性質例如穩定性和/或溶解性進行篩選。本專利技術提供“功能共有區"(functionalconsensus)方法且證實其優點,其基于功能性選擇的(functionally_selected)scFv序列數據庫的使用，鑒定scFv構架內的優選氨基酸置換。因此，本專利技術提供了改造免疫結合劑(例如scFv)的 方法，其通過使特定構架氨基酸位置突變成使用本文描述的“功能共有區”方法鑒定的特定氨基酸殘基。再進一步地，本專利技術提供了基于本文描述的“功能共有區”方法設計的scFv構架支架，其可以用作目的CDR序列可以插入其內以制備針對靶目的抗原的免疫結合劑例如scFv的構架序列。優選地，在本專利技術的改造方法中使用或由本專利技術的改造方法產生的免疫結合劑是scFv，但其他免疫結合劑例如全長免疫球蛋白、Fab片段、單結構域抗體(例如Dab)和納米抗體也可以根據本專利技術的方法進行改造。本專利技術還包含了根據改造方法制備的免疫結合齊U，以及包含所述免疫結合劑和藥學上可接受的載體的組合物。在一個方面，本專利技術提供了改造免疫結合劑的方法，所述免疫結合劑包含(i )重鏈可變區或其片段，所述重鏈可變區包含Vh構架殘基，和/或(ii )輕鏈可變區或其片段，所述輕鏈可變區包含\構架殘基，所述方法包括A)選擇在Vh構架殘基、' 構架殘基或Vh和\構架殘基內的一個或多個氨基酸位置用于突變；和B)使選擇用于突變的一個或多個氨基酸位置突變，其中選擇用于突變的一個或多個氨基酸位置和在所選擇的一個或多個位置處插入的一個或多個氨基酸殘基在下文進一步詳細描述。下文描述的氨基酸位置編號使用AHo編號系統；使用Kabat編號系統的對應位置在本文中進一步描述，并且關于AHo和Kabat編號系統的換算表在實施例I中闡述。使用標準單字母縮寫編碼闡述氨基酸殘基。在一個實施方案中，其中如果選擇用于突變的一個或多個氨基酸位置在重鏈可變區，那么突變包括選自下述的一個或多個置換(a)在氨基酸位置I處的Q或E ;(b)在氨基酸位置6處的Q或E ;(c)在氨基酸位置7處的T、S或A，更優選T或A，更加優選T ；(d)在氨基酸位置10處的A、T、P、V或D，更優選T、P、V或D ;(e)在氨基酸位置12處的L或V，更優選L ;(f)在氨基酸位置13處的V、R、Q、M或K，更優選V、R、Q或M ;(g)在氨基酸位置14處的R、M、E、Q或K，更優選R、M、E或Q，更加優選R或E ;(h)在氨基酸位置19處的L或V，更優選L ；(i )在氨基酸位置20處的R、T、K或N，更優選R、T或N，更加優選N ；(j)在氨基酸位置21處的I、F、L或V，更優選I、F或L，更加優選I或L ;(k)在氨基酸位置45處的R或K，更優選K;(I)在氨基酸位置47處的T、P、V、A或R，更優選T、P、V或R，更加優選R ；(m)在氨基酸位置50處的K、Q、H或E，更優選K、H或E，更加優選K ；(η)在氨基酸位置55處的M或I，更優選I ;(ο)在氨基酸位置77處的K或R，更優選K ；(P)在氨基酸位置78處的Α、V、L或I，更優選A、L或I，更加優選A ；(q)在氨基酸位置82處的E、R、T或Α，更優選Ε、Τ或Α，更加本文檔來自技高網...
【技術保護點】
改造免疫結合劑的方法，所述免疫結合劑包含（i）重鏈可變區或其片段，所述重鏈可變區包含VH構架殘基，和/或（ii）輕鏈可變區或其片段，所述輕鏈可變區包含VL構架殘基，所述方法包括：A）選擇在所述VH構架殘基、VL構架殘基或VH和VL構架殘基內的一個或多個氨基酸位置用于突變；和B）使選擇用于突變的所述一個或多個氨基酸位置突變，a）其中如果選擇用于突變的所述一個或多個氨基酸位置在重鏈可變區，那么所述突變包括選自下述的一個或多個置換：（a）使用AHo或Kabat編號系統的氨基酸位置1處的谷氨酸（E）或谷氨酰胺（Q）；（b）使用AHo或Kabat編號系統的氨基酸位置6處的谷氨酸（E）或谷氨酰胺（Q）；（c）使用AHo或Kabat編號系統的氨基酸位置7處的蘇氨酸（T）、絲氨酸（S）或丙氨酸（A）；（d）使用AHo編號系統的氨基酸位置10（使用Kabat編號系統的氨基酸位置9）處的丙氨酸（A）、蘇氨酸（T）、脯氨酸（P）、纈氨酸（V）或天冬氨酸（D）；（e）使用AHo編號系統的氨基酸位置12（使用Kabat編號系統的氨基酸位置11）處的亮氨酸（L）或纈氨酸（V）；（f）使用AHo編號系統的氨基酸位置13（使用Kabat編號系統的氨基酸位置12）處的纈氨酸（V）、精氨酸（R）、谷氨酰胺（Q）、甲硫氨酸（M）或賴氨酸（K）；（g）使用AHo編號系統的氨基酸位置14（使用Kabat編號系統的氨基酸位置13）處的精氨酸（R）、甲硫氨酸（M）、谷氨酸（E）、谷氨酰胺（Q）或賴氨酸（K）；（h）使用AHo編號系統的氨基酸位置19（使用Kabat編號系統的氨基酸位置18）處的亮氨酸（L）或纈氨酸（V）；（i）使用AHo編號系統的氨基酸位置20（使用Kabat編號系統的氨基酸位置19）處的精氨酸（R）、蘇氨酸（T）、賴氨酸（K）或天冬酰胺（N）；（j）使用AHo編號系統的氨基酸位置21（使用Kabat編號系統的氨基酸位置20）處的異亮氨酸（I）、苯丙氨酸（F）、亮氨酸（L）或纈氨酸（V）；（k）使用AHo編號系統的氨基酸位置45（使用Kabat編號系統的氨基酸位置38）處的精氨酸（R）或賴氨酸（K）；（l）使用AHo編號系統的氨基酸位置47（使用Kabat編號系統的氨基酸位置40）處的蘇氨酸（T）、脯氨酸（P）、纈氨酸（V）、丙氨酸（A）或精氨酸（R）；（m）使用AHo編號系統的氨基酸位置50（使用Kabat編號系統的氨基酸位置43）處的賴氨酸（K）、谷氨酰胺（Q）、組氨酸（H）或谷氨酸（E）；（n）使用AHo編號的氨基酸位置55（使用Kabat編號的氨基酸位置48）處的甲硫氨酸（M）或異亮氨酸（I）；（o）使用AHo編號的氨基酸位置77（使用Kabat編號的氨基酸位置66）處的賴氨酸（K）或精氨酸（R）；（p）使用AHo編號系統的氨基酸位置78（使用Kabat編號系統的氨基酸位置67）處的丙氨酸（A）、纈氨酸（V）、亮氨酸（L）或異亮氨酸（I）；（q）使用AHo編號系統的氨基酸位置82（使用Kabat編號系統的氨基酸位置71）處的谷氨酸（E）、精氨酸（R）、蘇氨酸（T）或丙氨酸（A）；（r）使用AHo編號系統的氨基酸位置86（使用Kabat編號系統的氨基酸位置75）處的蘇氨酸（T）、絲氨酸（S）、異亮氨酸（I）或亮氨酸（L）；（s）使用AHo編號系統的氨基酸位置87（使用Kabat編號系統的氨基酸位置76）處的天冬氨酸（D）、絲氨酸（S）、天冬酰胺（N） 或甘氨酸（G）；（t）使用AHo編號系統的氨基酸位置89（使用Kabat編號系統的氨基酸位置78）處的丙氨酸（A）、纈氨酸（V）、亮氨酸（L）或苯丙氨酸（F）；（u）使用AHo編號系統的氨基酸位置90（使用Kabat編號系統的氨基酸位置79）處的苯丙氨酸（F）、絲氨酸（S）、組氨酸（H）、天冬氨酸（D）或酪氨酸（Y）；（v）使用AHo編號系統的氨基酸位置92（使用Kabat編號系統的氨基酸位置81）處的天冬氨酸（D）、谷氨酰胺（Q）或谷氨酸（E）；（w）使用AHo編號系統的氨基酸位置95（使用Kabat編號系統的氨基酸位置82b）處的甘氨酸（G）、天冬酰胺（N）、蘇氨酸（T）或絲氨酸（S）；（x）使用AHo編號的氨基酸位置98（使用Kabat編號的氨基酸位置84）處的蘇氨酸（T）、丙氨酸（A）、脯氨酸（P）、苯丙氨酸（F）或絲氨酸（S）；（y）使用AHo編號系統的氨基酸位置103（使用Kabat編號的氨基酸位置89）處的精氨酸（R）、谷氨酰胺（Q）、纈氨酸（V）、異亮氨酸（I）、亮氨酸（L）、甲硫氨酸...
【技術特征摘要】
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【專利技術屬性】
技術研發人員：D·尤里奇，L·博拉斯，
申請(專利權)人：艾斯巴技術，愛爾康生物醫藥研究裝置有限責任公司，
類型：發明
國別省市：
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