本發(fā)明專利技術(shù)公開(kāi)了一種產(chǎn)酯酶的腸桿菌，所述腸桿菌產(chǎn)生的酯酶的蛋白質(zhì)序列，該酯酶的基因，含有該基因的重組表達(dá)子和重組表達(dá)轉(zhuǎn)化體，以及重組酯酶及其制備方法。本發(fā)明專利技術(shù)還公開(kāi)了利用該腸桿菌整細(xì)胞，其酯酶或其重組酯酶催化消旋(±)-苯基縮水甘油酸甲酯對(duì)映選擇性水解，制備生產(chǎn)手性紫杉醇前體(2S，3R)-苯基縮水甘油酸甲酯的用途。所述腸桿菌（Enterobacter?sp.）ECU?1107的保藏編號(hào)為CGMCC?No.5981。采用本發(fā)明專利技術(shù)提供的腸桿菌整細(xì)胞，其酯酶或重組酯酶催化制備紫杉醇前體，工藝簡(jiǎn)單，反應(yīng)條件溫和，催化效率高，產(chǎn)物光學(xué)純度好，對(duì)映體過(guò)量值(ee)>99%，具有很好的工業(yè)應(yīng)用前景。
【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)具體涉及一種產(chǎn)立體選擇性酯酶的腸桿菌，該酯酶蛋白質(zhì)，編碼該酯酶的基因，含有該基因的重組載體和重組表達(dá)轉(zhuǎn)化體，所述酯酶及其重組酯酶的制備方法，以及所述腸桿菌整細(xì)胞，或所述酯酶，或其重組酯酶作為催化劑在制備紫杉醇手性前體(2S，3R)-苯基縮水甘油酸甲酯中的應(yīng)用。
技術(shù)介紹
光學(xué)活性的苯基縮水甘油酸甲酯是一種重要的手性砌塊，(2S，3R)_苯基縮水甘油酸甲酯可以用于合成抗癌藥物紫杉醇的側(cè)鏈，也可以作為手性藥物黃皮酰胺的起始材料。紫杉醇具有良好的抗腫瘤活性，對(duì)于卵巢癌、乳腺癌、肺癌、白血病、腸胃癌等多種癌癥具有良好的治療作用，而黃皮酰胺具有促智作用，是一種抗老年癡呆藥物。如何獲得單一構(gòu)型的光學(xué)純苯基縮水甘油酸甲酯已成為人們所關(guān)注和研究的重要課題。目前光學(xué)純紫杉醇手性前體苯基縮水甘油酸甲酯的制備方法主要分為化學(xué)不對(duì)稱合成法和酶促拆分法。化學(xué)不對(duì)稱合成法主要是α，β_不飽和酮或酯的不對(duì)稱環(huán)氧化(Journal of Organic Chemistry, 2004, 69:4216-4226;Chemistry-An AsianJournal, 2007, 2:257-264 和 Advanced Synthesis&Catalysis, 2009, 351:1685-1691)。然而這種方法合成的是(2R，3S)_構(gòu)型的苯基縮水甘油酸甲酯。酶促拆分法包括苯基縮水甘油酸甲酯的轉(zhuǎn)酯化拆分以及水解拆分兩種(Advanced Synthesis&Catalysis, 2001, 343:721-725和WO Patent2004087932)，苯基縮水甘油酸甲酯的轉(zhuǎn)酯化拆分法選擇性低，產(chǎn)物分離困難。Zheng等用惡臭假單胞菌(Peseudomonas putida)整細(xì)胞為催化劑,催化苯基縮水甘油酸甲酯的水解拆分，30°C反應(yīng)12h得到了對(duì)映體過(guò)量值(ee)為99%的(2S，3R)-苯基縮水甘油酸甲酯(Journal of Molecular Catalysis B:Enzymatic, 2006，43:133-136)。盡管如此，該方法底物濃度較低，僅為50 60mM左右、催化劑活性差，反應(yīng)時(shí)間較長(zhǎng)，不適宜于工業(yè)化應(yīng)用。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
因此，本專利技術(shù)要解決的技術(shù)問(wèn)題就是針對(duì)現(xiàn)有的酯酶催化紫杉醇手性前體苯基縮水甘油酸甲酯水解拆分反應(yīng)時(shí)酶催化活性偏低、底物耐受性差、反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)等問(wèn)題，提供一種催化活性高、對(duì)映選擇性好、底物耐受性好、反應(yīng)時(shí)間短的腸桿菌菌株(Enterobactersp. ) ECU 1107以及該酯酶蛋白質(zhì)，編碼該酯酶蛋白質(zhì)的基因，含有該基因的重組表達(dá)載體，含有該載體的重組表達(dá)轉(zhuǎn)化體以及該重組酯酶的制備方法。本專利技術(shù)還公開(kāi)了利用上述腸桿菌菌株、酯酶和重組表達(dá)轉(zhuǎn)化體作為催化劑，催化拆分水解反應(yīng)制備紫杉醇手性前體(2S, 3R)-苯基縮水甘油酸甲酯的方法。為解決上述技術(shù)問(wèn)題,本專利技術(shù)采取的技術(shù)方案之一是一種腸桿菌(Enterobactersp. )ECU 1107，其保藏編號(hào)為 CGMCC No. 5981。本專利技術(shù)人從中國(guó)上海、江蘇、浙江、山東、黑龍江、海南等省市以及越南順化等地采集土樣，從土壤微生物中經(jīng)過(guò)初篩、復(fù)篩和分離純化，得到一種能夠選擇性催化苯基縮水甘油酸甲酯對(duì)映選擇性水解制備(2S，3R)_苯基縮水甘油酸甲酯的腸桿菌，將其命名為腸桿菌(Enterobacter sp. ) EQJ 1107。該菌株已于2012年4月10日保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，保藏號(hào)為CGMCC No. 5981。本專利技術(shù)所述的腸桿菌具有如下微生物學(xué)特征(I)形態(tài)特征短桿菌，革蘭氏染色陰性，具有周身鞭毛幫助運(yùn)動(dòng)，大小約為長(zhǎng)I. 2 3. O μ m、寬O. 6 I. O μ m。(2)固體平板培養(yǎng)基上的菌落特征(30°C培養(yǎng)48h)該菌株呈粘液狀，濕潤(rùn)、光滑，乳白色。·(3)生長(zhǎng)環(huán)境該菌株可在溫度15 40°C范圍內(nèi)生長(zhǎng)，在pH5 9，NaCl濃度O 7%(w/v)的環(huán)境中生存。其中所述腸桿菌(Enterobacter sp. ) ECU 1107的培養(yǎng)基成分包括葡萄糖含量較佳地為I 20g/L，優(yōu)選地為10g/L，蛋白胨含量較佳地為I 20g/L，優(yōu)選地為5g/L，酵母膏含量較佳地為I 20g/L，優(yōu)選地為5g/L，KH2PO4含量較佳地為O. I 3g/L，優(yōu)選地為lg/L，MgSO4含量較佳地為O. I 3g/L，優(yōu)選地為O. 5g/L，NaCl含量較佳地為O. I 3g/L，優(yōu)選地為lg/L，pH較佳地為5 8，優(yōu)選地為7，115°C滅菌30分鐘。所述腸桿菌(Enterobacter sp. ) ECU 1107的培養(yǎng)方法較佳地包括搖瓶培養(yǎng)其中，所述搖瓶裝液量較佳地為10 30%，優(yōu)選地為20% (v/v)，接種量較佳地為I 10%，優(yōu)選地為1%(ν/ν)，培養(yǎng)溫度較佳地為20 40°C，優(yōu)選地為25 35°C，搖床轉(zhuǎn)速100 200rpm，優(yōu)選地為180rpm，培養(yǎng)時(shí)間較佳地為I 3天,優(yōu)選地為24小時(shí),培養(yǎng)液離心、洗滌之后得到菌體。所述腸桿菌(Enterobacter sp. )EOJ 1107的培養(yǎng)方法較佳地還包括發(fā)酵罐培養(yǎng)培養(yǎng)基與搖瓶培養(yǎng)相同。發(fā)酵罐裝液量較佳地為40 60%(v/v)，115°C滅菌30分鐘，接入5 10% (v/v)種子培養(yǎng)液，培養(yǎng)溫度較佳地為25 35°C，pH較佳地為6. O 8. 0，通氣量較佳地為2. O 4. OL/min,攪拌轉(zhuǎn)速較佳地為200 400轉(zhuǎn)/分，發(fā)酵的時(shí)間較佳地為12 36小時(shí)，發(fā)酵液離心收集菌體。為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本專利技術(shù)采取的技術(shù)方案之二是一種分離的蛋白質(zhì)，其是如下(a)或(b)的蛋白質(zhì)(a)其氨基酸序列如序列表中SEQ ID No:2所示的蛋白質(zhì)；(b)在(a)中的氨基酸序列中經(jīng)過(guò)取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基且具有酯酶活性的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。其中所述的其氨基酸序列如序列表中SEQ ID No:2所示的蛋白質(zhì)可以從腸桿菌(Enterobacter sp. )E⑶1107中分離獲得,也可以從重組表達(dá)該蛋白質(zhì)的表達(dá)轉(zhuǎn)化體中分離獲得，也可以人工合成獲得。蛋白質(zhì)(b)是在(a)的氨基酸序列中經(jīng)過(guò)取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且具有酯酶活性的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。其中所述的“幾個(gè)”是指二個(gè)至小于100個(gè)，更佳的小于30個(gè)。較佳地包括添加一個(gè)外分泌信號(hào)肽的融合蛋白，本專利技術(shù)發(fā)現(xiàn)這樣的融合蛋白同樣具有酯酶活性。也就是說(shuō)，只要由(a)衍生的蛋白質(zhì)具有酯酶活性，且衍生方式如上所述，都可以達(dá)到本專利技術(shù)的專利技術(shù)目的。為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本專利技術(shù)采取的技術(shù)方案之三是一種分離的核酸，其是如下(I)或⑵的核酸(I)其核苷酸序列如序列表中SEQ ID No: I所示的核酸；(2)編碼如下蛋白質(zhì)(a)或(b)的基因(a)其氨基酸序列如序列表中SEQ ID No:2所示的蛋白質(zhì)； (b)在(a)中的氨基酸序列經(jīng)過(guò)取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且具有酯酶活性的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。本專利技術(shù)所述核苷酸序列如SEQ ID No: I所示的核酸較佳地包括從腸桿菌(Enterobacter sp. )EOJ 1107基因組中分離獲得,從含有本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種腸桿菌（Enterobacter？sp.）ECU？1107，其保藏編號(hào)為CGMCC？No.5981。
【技術(shù)特征摘要】
1.一種腸桿菌(Enterobacter sp. ) ECU 1107，其保藏編號(hào)為 CGMCC No. 5981。2.一種分離的蛋白質(zhì)，其特征在于其是如下(a)或(b)的蛋白質(zhì) (a)其氨基酸序列如序列表中SEQID No:2所示的蛋白質(zhì)； (b)在(a)中的氨基酸序列中經(jīng)過(guò)取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基且具有酯酶活性的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。3.一種分離的核酸，其特征在于，其是如下(I)或(2)的核酸 (1)其核苷酸序列如序列表中SEQID No: I所示的核酸； (2)編碼如下蛋白質(zhì)(a)或(b)的基因 (a)其氨基酸序列如序列表中SEQID No:2所示的蛋白質(zhì)； (b)在(a)中的氨基酸序列經(jīng)過(guò)取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且具有酯酶活性的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。4.一種包含如權(quán)利要求3所述的核酸的重組表達(dá)載體。5.一種包含如權(quán)利要求4所述的重組表達(dá)載體的重組表達(dá)轉(zhuǎn)化體。6.一種重組酯酶的制備方法，其特征在于，該制備方法包括培養(yǎng)如權(quán)利要求5所述的重組表達(dá)轉(zhuǎn)化體，從培養(yǎng)物中獲得重組表達(dá)的酯酶。7.一種酯酶的制備方法，其特征在于，其方...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：許建和，周冬杰，潘江，李春秀，郁惠蕾，鄭高偉，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：華東理工大學(xué)，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：
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