一種γ-谷氨酰轉肽酶固定化酶及其制備方法和應用技術

本發(fā)明專利技術公開了一種γ-谷氨酰轉肽酶固定化酶，它包括酶、固定所述酶的載體和包覆材料，所述的酶為γ-谷氨酰轉肽酶，所述的載體為鎳親和載體，所述的包覆材料為聚乙烯亞胺。本發(fā)明專利技術還公開了上述γ-谷氨酰轉肽酶固定化酶的制備方法及其應用。本發(fā)明專利技術所得到的γ-谷氨酰轉肽酶固定化酶具有制備簡單快速、酶穩(wěn)定性強、重復使用性能好等特點，為進一步提高γ-谷氨酰轉肽酶的穩(wěn)定性以適應工業(yè)化應用奠定基礎。

【技術實現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術屬于生物技術和酶工程領域，具體涉及一種固定化酶及其制備方法和應用。
技術介紹
y -谷氨酰轉肽酶(Y -glutamyltranspeptidase, GGT, EC 2. 3. 2. 2)是生物體內谷氨酰循環(huán)中的關鍵酶，可特異性催化Y-谷氨酰基轉移至受體分子，得到新的含Y-谷氨 酰基的化合物。通過改變受體種類可獲得不同的谷氨酰化合物，如催化合成藥物或藥物的前體，如L- Y -谷氨酰-L-多巴，它是帕金森綜合癥的前體藥物；谷胱甘肽，其在臨床上用于肝病的輔助治療、有機物及重金屬的戒毒等。由于其催化具有位點特異性和光學選擇性強，無需對反應物進行側鏈保護和脫保護，無需輔酶、反應過程中也不消耗ATP等優(yōu)點，而成為工業(yè)生物催化領域的研究熱點。由于Y-谷氨酰轉肽酶在堿性(pH>9. O)條件下已發(fā)生亞基解聚，從而導致酶活的不可逆下降，限制了其在工業(yè)合成領域的應用。目前，已有的固定化方法對于提高其PH穩(wěn)定性的作用有限。
技術實現(xiàn)思路
本專利技術所要解決的技術問題是提供一種Y-谷氨酰轉肽酶固定化酶，可以實現(xiàn)重組Y-谷氨酰轉肽酶的一步純化-固定化，并提高重組Y-谷氨酰轉肽酶的穩(wěn)定性，降低制備谷氨酰化合物的合成工藝成本。本專利技術還要解決的技術問題是提供上述Y-谷氨酰轉肽酶固定化酶固定化酶的制備方法。本專利技術最后要解決的技術問題是提供上述Y-谷氨酰轉肽酶固定化酶的應用。為解決上述技術問題，本專利技術采用的技術方案如下一種Y-谷氨酰轉肽酶固定化酶，它包括酶、固定所述酶的載體和包覆材料，所述的酶為Y-谷氨酰轉肽酶，所述的載體為鎳親和載體，所述的包覆材料為聚乙烯亞胺。其中，所述的鎳親和載體為Ni Sepharose 6 Fast Flow親和載體，其購自GEhealthcare公司，同類鎳親和載體均適用。上述Y-谷氨酰轉肽酶固定化酶的制備方法，將鎳親和載體，加入含有重組Y-谷氨酰轉肽酶的細胞破碎液中，于4 45°C下振蕩反應I 6h后，將液體濾出；固體顆粒用pH7. O 9. O的含有200mmol/L咪唑的30 60mmol/L Tris-HCl緩沖液反復清洗2 3次，將液體濾出；固體顆粒再用pH7. O 9. O的30 60mmol/L Tris-HCl緩沖液反復清洗2 3次，將液體濾出；固體顆粒再用PH7. O 9. O的O. 2 1%(ν/ν)的聚乙烯亞胺水溶液，于4 45°C震蕩反應12 24h后，固體顆粒再用ρΗ7· O 9. O的30 60mmol/L Tris-HCl緩沖液反復清洗2 3次，將液體濾出，即制得Y -谷氨酰轉肽酶固定化酶。上述Y -谷氨酰轉肽酶固定化酶的制備方法，優(yōu)選的是，將鎳親和載體，加入含有重組Y-谷氨酰轉肽酶的細胞破碎液中，于4°C下振蕩反應Ih后，將液體濾出，固體顆粒用PH8. O的含有200mmol/L咪唑的50mmol/L Tris-HCl緩沖液反復清洗2 3次，將液體濾出；固體顆粒再用PH8. O的50mmol/L Tris-HCl緩沖液反復清洗2 3次，將液體濾出；固體顆粒再用PH7. O的O. 2%(v/v)的聚乙烯亞胺水溶液，于4 V震蕩反應12h后，固體顆粒再用pH8. O的50mmol/L Tris-HCl緩沖液反復清洗2 3次，將液體濾出，即制得Y -谷氨酰轉肽酶固定化酶。其中，所述的細胞破碎液，Y-谷氨酰轉肽酶的酶活為10U/mL以上。其中，其·特征在于對每g濕質量的鎳親和載體，含有重組Y-谷氨酰轉肽酶的細胞破碎液加入體積為10 30mL,優(yōu)選為10mL。其中，對每g濕質量的鎳親和載體，加入pH7. O的O. 2%(v/v)的聚乙烯亞胺水溶液體積為10 30mL,優(yōu)選為10mL。其中，制備得到的Y -谷氨酰轉肽酶固定化酶在ρΗ7· O 9. O的30 60mmol/LTris-HCl緩沖液中保存。上述Y-谷氨酰轉肽酶固定化酶在催化制備Y-谷氨酰基化合物中的應用。通過本專利技術方法制備得到的聚乙烯亞胺包覆鎳親和固定化酶可用于催化制備系列Y-谷氨酰基化合物。有益效果本專利技術充分利用鎳親和載體對于重組Y -谷氨酰轉肽酶上His-Taq標簽的特異性吸附，直接從細胞破碎液中吸附重組Y-谷氨酰轉肽酶，再用含有咪唑的緩沖液洗去雜質，達到純化-固定化一步完成。在固定化酶的基礎上包覆一層聚乙烯亞胺高分子，大大提高固定化酶在不同PH條件下，尤其是堿性(pH>9. O)條件下的穩(wěn)定性，從而為實現(xiàn)固定化重組Y-谷氨酰轉肽酶工業(yè)應用提供了良好的前提條件。通過本專利技術方法制備的聚乙烯亞胺包覆鎳親和固定化酶酶活力回收率平均達到20. 0% ;與游離酶相比，固定化酶的最適作用PH和溫度并無改變，但固定化酶的pH穩(wěn)定性較游離酶有大幅度提高，且重復使用性能好。附圖說明圖I為游離酶和固定化酶的最適pH值，圖中顯示Y-谷氨酰轉肽酶的聚乙烯亞胺包覆鎳親和固定化酶的最適pH為9。圖2為游離酶和固定化酶的最適溫度，圖中顯示Y-谷氨酰轉肽酶的聚乙烯亞胺包覆鎳親和固定化酶的最適溫度為50°C。圖3為游離酶和固定化酶的pH穩(wěn)定性，圖中顯示Y -谷氨酰轉肽酶的聚乙烯亞胺包覆鎳親和固定化酶的穩(wěn)定性得到了明顯改善，在各PH條件下，經(jīng)過聚乙烯亞胺包覆的固定化酶的穩(wěn)定性均較游離酶有大幅提高，在PH 11. O條件下保存15小時，固定化酶的殘余酶活可達44. 4%。圖4為游離酶和固定化酶的保溫4h后的熱穩(wěn)定性，圖中顯示Y-谷氨酰轉肽酶的聚乙烯亞胺包覆鎳親和固定化酶的熱穩(wěn)定性在45°C以下條件中有所提高，當保溫在45°C下4h時固定化酶的殘余酶活為初始值的77. 6%。圖5為Y -谷氨酰轉肽酶的聚乙烯亞胺包覆鎳親和固定化酶的使用穩(wěn)定性，圖中顯示隨著轉化次數(shù)的增多，固定化酶的活力略有下降，但經(jīng)儲存約30d，轉化20個批次后，聚乙烯亞胺包覆鎳親和固定化酶活力仍可保持初始值的70%左右。具體實施例方式根據(jù)下述實施例，可以更好地理解本專利技術。然而，本領域的技術人員容易理解，實施例所描述的具體的物料配比、工藝條件及其結果僅用于說明本專利技術，而不應當也不會限制權利要求書中所詳細描述的本專利技術。以下實施例所使用的Ni Sepharose 6 Fast Flow親和載體購自GE healthcare公司。具體性質可參考說明書。以下實施例中酶活力檢測方法如下稱取O.Olg (濕重)固定化酶，和0.5mL5mmoI · L 1 Y -GpNA 溶液、O. 5mL O. IOmol · L 1 雙甘二妝溶液、I. 5mL SOmmoI /T, pH8. OTris-HCl緩沖一起加入砂芯反應管中。37°C，振蕩速度120r · mirT1，反應20min。反應 液濾出于紫外分光光度計(λ =410nm)下測定吸光值，根據(jù)標準曲線計算對硝基苯胺濃度。以下實施例中酶活回收率計算方法如下回收率=(固定化酶活力/總投入酶活)X 100%實施例I :Ni Sepharose 6 Fast Flow親和載體上重組Y -谷氨酰轉肽酶的固定化稱取I.Og Ni Sepharose 6Fast Flow親和載體置于砂芯管中，加入含有重組Y -谷氨酰轉肽酶的細胞破碎液IOmL (酶活為13. 06U/mL),于4°C冰浴振蕩反應lh。反應結束后用pH8. O含有200mmo本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術保護點】
一種γ？谷氨酰轉肽酶固定化酶，其特征在于，它包括酶、固定所述酶的載體和包覆材料，所述的酶為γ？谷氨酰轉肽酶，所述的載體為鎳親和載體，所述的包覆材料為聚乙烯亞胺。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發(fā)人員：姚忠，田思思，周治，王浩綺，熊強，仲兆祥，徐虹，
申請(專利權)人：南京工業(yè)大學，
類型：發(fā)明
國別省市：