本發(fā)明專利技術(shù)提供了編碼超嗜熱菌焦磷酸酶蛋白的核酸SEQIDNO：1或3的核酸，酶蛋白SEQIDNO:2或4，以及用分離的超嗜熱菌焦磷酸酶蛋白測(cè)序的方法。
【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
【國(guó)外來(lái)華專利技術(shù)】
本專利技術(shù)提供了純化和利用無(wú)機(jī)焦磷酸酶的系統(tǒng)、方法、試劑和試劑盒。更具體地，本專利技術(shù)涉及無(wú)機(jī)焦磷酸酶的有效分離及其在核酸擴(kuò)增和測(cè)序技術(shù)中的用途。
技術(shù)介紹
許多擴(kuò)增和測(cè)序策略采用聚合酶用于將核苷酸種類(nucleotide species)添加至新合成的核酸分子。通常理解的是，對(duì)于聚合酶摻入的每種核苷酸種類，焦磷酸分子(通常也被稱為“PPi”)和氫分子被釋放進(jìn)反應(yīng)環(huán)境中。這可以是采用非常小的反應(yīng)環(huán)境的擴(kuò)增和測(cè)序策略中的非常重要的考慮，因?yàn)榻?jīng)過(guò)聚合酶的許多摻入事件，PPi分子在反應(yīng)環(huán)境中聚集，達(dá)到一定濃度，在該濃度時(shí)PPi對(duì)聚合酶摻入核苷酸種類的能力具有抑制作用。 此外，存在依賴于檢測(cè)PPi釋放的能力的測(cè)序技術(shù)。例如，可以采用測(cè)定釋放的PPi的相對(duì)量或PPi濃度的改變來(lái)表示與模板分子的序列位置的核苷酸種類互補(bǔ)的核苷酸種類的摻入。檢測(cè)或測(cè)定的模式可以包括反應(yīng)環(huán)境中PH的改變，或者通過(guò)產(chǎn)生對(duì)于每個(gè)摻入的核苷酸分子的光的光子的酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)，這通常被稱為“焦磷酸測(cè)序(Pyrosequencing) ”。在本例子中,測(cè)定的PPi的程度與摻入的核苷酸分子的數(shù)量是直接成比例的，因此，對(duì)于此處所述的測(cè)序策略非常重要的是，在核苷酸引入步驟(即下面進(jìn)一步討論的核苷酸流(nucleotide flow))中檢測(cè)的PPi是該步驟期間從該特定的核苷酸摻入所釋放的結(jié)果，而不是來(lái)自前一步驟的殘留分子。因此，降低PPi的濃度或?qū)⑵鋸姆磻?yīng)環(huán)境完全去除的策略在所述的擴(kuò)增和測(cè)序背景中是非常期望的。通常，這可以通過(guò)使用與PPi分子反應(yīng)并使之特異性降解的焦磷酸酶(PPi-ase)來(lái)完成。以前鑒定的分離的焦磷酸酶試劑的形式包括源自超好熱性古細(xì)菌(Thermococcus 7iiora7i5·)的種類，可以從 New England Biolabs, Inc.(也被稱為 NEB,Ipswich Massachusetts)獲得。然而，仍然需要表現(xiàn)出用于在擴(kuò)增和測(cè)序技術(shù)中使用所需的特征的其它分離的焦磷酸酶試劑種類。專利技術(shù)概述 本專利技術(shù)的實(shí)施方案涉及核酸序列的測(cè)定。更具體而言，本專利技術(shù)的實(shí)施方案涉及用于校正在通過(guò)邊合成邊測(cè)序(sequencing by synthesis (SBS))的核酸測(cè)序期間獲得的數(shù)據(jù)中的錯(cuò)誤的方法和系統(tǒng)。描述了核酸的實(shí)施方案，其包括編碼超嗜熱菌(Aae)焦磷酸酶蛋白的核酸SEQ IDN0:1或3。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，核酸編碼His標(biāo)簽。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，核酸編碼BCCP生物素化位點(diǎn)。此外，描述了使用分離的焦磷酸酶蛋白的測(cè)序方法的實(shí)施方案，其包括如下步驟在包含源自超嗜熱菌(Aquifex aeolicus)物種的酶蛋白SEQ ID NO :2或4的反應(yīng)環(huán)境中進(jìn)行測(cè)序反應(yīng)，其中所述酶蛋白包括焦磷酸酶活性。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，酶蛋白結(jié)合于珠子。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，酶蛋白通過(guò)生物素連接結(jié)合于珠子。在仍進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用體內(nèi)過(guò)程將生物素有效地偶聯(lián)于蛋白。在仍進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，酶蛋白是熱穩(wěn)定的。在仍進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，在多個(gè)反應(yīng)環(huán)境中同時(shí)進(jìn)行多個(gè)測(cè)序反應(yīng)。上述實(shí)施方案和實(shí)施方式不必彼此包容或排斥，可以以不沖突的以及可能的其它任何方式組合，無(wú)論它們是否與相同的或不同的實(shí)施方案或?qū)嵤┓绞酱嬖凇?shí)施方案或?qū)嵤┓绞降拿枋霾⒉灰庠谙拗破渌鼘?shí)施方案和/或?qū)嵤┓绞健６遥诒菊f(shuō)明書(shū)中其它地方所述的任何一種或多種功能、步驟、操作或技術(shù)可以在其它實(shí)施方式中與摘要中所述的任何一種或多種功能、步驟、操作或技術(shù)相結(jié)合。因此，上述的實(shí)施方案和實(shí)施方式是說(shuō)明性的而非限制性的。附圖簡(jiǎn)要說(shuō)明 當(dāng)與附圖相結(jié)合時(shí)，可以從下面詳細(xì)的描述中更清楚地理解上述的進(jìn)一步的特征。在附圖中，相同的參照數(shù)表示相同的結(jié)構(gòu)、元件或方法步驟，參照數(shù)的最左邊的數(shù)字表示參照元件首次出現(xiàn)的圖中的數(shù)字(例如，元件160首先出現(xiàn)在圖I中)。然而，所有這些規(guī)則的本意是典型性的或說(shuō)明性的，而非限制性的。圖I是在計(jì)算機(jī)控制下的測(cè)序儀和反應(yīng)底物的一種實(shí)施方案的功能方框 圖2是超嗜熱菌焦磷酸酶融合分子的一種實(shí)施方案的簡(jiǎn)化的圖例； 圖3A和3B是超好熱性古細(xì)菌(7 Iitoralis)的一種實(shí)施方案和超嗜熱菌焦磷酸酶的一種實(shí)施方案的活性水平的比較的簡(jiǎn)化的圖例； 圖4是超嗜熱菌焦磷酸酶的一種實(shí)施方案所示的熱穩(wěn)定性的簡(jiǎn)化的圖例； 圖5A和5B是用結(jié)合于珠子的超好熱性古細(xì)菌焦磷酸酶的一種實(shí)施方案和超嗜熱菌焦磷酸酶的一種實(shí)施方案在珠子上從大腸桿菌獲得的測(cè)序結(jié)果的比較的簡(jiǎn)化的圖例； 圖6A和6B是用結(jié)合于珠子的超好熱性古細(xì)菌焦磷酸酶的一種實(shí)施方案和超嗜熱菌焦磷酸酶的一種實(shí)施方案在珠子上從空腸彎曲菌Γ6；獲得的測(cè)序結(jié)果的比較的簡(jiǎn)化的圖例；和 圖7A和7B是用結(jié)合于珠子的超好熱性古細(xì)菌焦磷酸酶的一種實(shí)施方案和超嗜熱菌焦磷酸酶的一種實(shí)施方案在珠子上從極端嗜熱菌Γ7獲得的測(cè)序結(jié)果的比較的簡(jiǎn)化的圖例。專利技術(shù)的詳細(xì)描述 正如下面將更詳細(xì)描述的，本專利技術(shù)的實(shí)施方案包括用于源自超嗜熱菌的焦磷酸酶的純化的分離的核酸序列、蛋白序列和/或產(chǎn)物、表達(dá)系統(tǒng)、方法和試劑盒以及該酶的用途。具體而言，本專利技術(shù)的實(shí)施方案涉及編碼焦磷酸酶的分離的焦磷酸酶核酸序列以及由其衍生的融合序列，該融合序列包括實(shí)現(xiàn)處理步驟如純化和/或生物素化的一個(gè)或多個(gè)元件，尤其可用于核酸模板分子的擴(kuò)增以及可用于高通量核酸測(cè)序技術(shù)中。a. P、體 術(shù)語(yǔ)“流程圖(flowgram)”通常是指SBS方法、尤其是基于焦磷酸鹽的測(cè)序方法(也被稱為“焦磷酸測(cè)序”)產(chǎn)生的序列數(shù)據(jù)的圖示，可以更特異性地稱為“焦磷酸圖(pyrogram)”。此處所用的術(shù)語(yǔ)“閱讀(read)”或“序列閱讀(sequence read)”通常是指從單一核酸模板分子或者模板核酸分子的多個(gè)基本上相同的拷貝的群體獲得的整個(gè)序列數(shù)據(jù)。此處所用的術(shù)語(yǔ)“運(yùn)行(run) ”或“測(cè)序運(yùn)行(sequencing run) ”通常是指在一個(gè)或多個(gè)模板核酸分子的測(cè)序操作中進(jìn)行的一系列測(cè)序反應(yīng)。此處所用的術(shù)語(yǔ)“流(flow) ”通常是指將溶液添加至包含模板核酸分子的環(huán)境的一系列或重復(fù)的循環(huán)，其中所述溶液可以包括用于添加至新生分子或其它試劑如緩沖液或酶的核苷酸種類，該緩沖液或酶可以用于測(cè)序反應(yīng)中，或用于從核苷酸種類的前面的流循環(huán)中減少延滯效應(yīng)(carryover effects)或噪聲效應(yīng)(noise effects)。此處所用的術(shù)語(yǔ)“流循環(huán)(flow cycle) ”通常是指一系列連續(xù)的流，其中在循環(huán)期間核苷酸種類流動(dòng)一次(即，流循環(huán)可以包括以Τ、A、C、G核苷酸種類的順序的連續(xù)添加，盡管其它序列的組合也被認(rèn)為是定義的一部分)。通常，流循環(huán)是從循環(huán)到循環(huán)具有相同流的序列的重復(fù)循環(huán)。此處所用的術(shù)語(yǔ)“閱讀長(zhǎng)度(read length) ”通常是指可以被可靠地測(cè)序的模板分子的長(zhǎng)度的上限。有許多對(duì)系統(tǒng)和/或方法的閱讀長(zhǎng)度有貢獻(xiàn)的因素，包括但不限于模板核酸分子中的GC含量的程度。此處所用的術(shù)語(yǔ)“測(cè)試片段(test fragment)”或“TF”通常是指已知序列組成的核酸元件，該元件可以用于質(zhì)量控制、校準(zhǔn)或其它相關(guān)的目的。 此處所用的術(shù)語(yǔ)“引物”通常是指在一定條件下作為DNA合成的起始點(diǎn)的寡核苷酸，在該條本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
【技術(shù)特征摘要】
【國(guó)外來(lái)華專利技術(shù)】...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：D格拉塔洛，KH林克，L皮諾，P桑岡，SG舍諾伊，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：霍夫曼拉羅奇有限公司，
類型：
國(guó)別省市：
還沒(méi)有人留言評(píng)論。發(fā)表了對(duì)其他瀏覽者有用的留言會(huì)獲得科技券。