本發明專利技術屬于細胞體外培養技術領域，分別建立了脂肪細胞(正常)/肝細胞共培養模型和脂肪細胞(炎癥)/肝細胞共培養模型，應用于降脂藥物的快速篩選。本發明專利技術提供的脂肪細胞與肝細胞共培養體系，是在Millicell雙層培養系統中，肝細胞貼壁培養在上層培養室的半透膜上，脂肪細胞貼壁培養在下層培養室的底面上；該培養體系是在體外條件下模擬脂肪組織對肝臟脂質代謝的調控作用；并以藥物對細胞因子、酶和受體的影響，應用于降脂藥物的快速篩選。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于細胞體外培養
，具體涉及一種脂肪細胞/肝細胞共培養模型進行降脂藥物快速篩選的模型及其應用
技術介紹
隨著經濟水平的發展，國民生活方式的改變，一系列脂代謝紊亂的疾病，如高脂血癥、非酒精性脂肪肝、代謝綜合征等疾病的發生率日趨上升。如2002年中國居民與健康狀況調查結果顯示我國血脂異常人數為I. 6億人，而2007年發布的《中國成人血脂異常防治指南》則顯示中國血脂異常現患率迅速攀升至18.6%。而近幾年脂肪肝的發病率也迅速上升，特別是在某些職業人群中(白領人士、出租車司機、職業經理人、個體業主、政府官員、高級知識分子等)脂肪肝的平均發病率為25% ;肥胖人群與II型糖尿病患者中脂肪肝的發病率為50%;嗜酒和酗酒者脂肪肝的發病率為58%。日趨嚴峻的脂質代謝紊亂疾病發病情況提示，臨床現用的降脂藥物效果并不理想，因此開發降脂藥物的任務迫在眉睫。近年來越來越多的研究資料表明，肥胖是脂代謝紊亂疾病的獨立危險因素，脂肪組織可能在其中發揮重要的作用。國內外大量研究結果表明脂肪組織不僅僅是能量儲存器官，也是一個活躍的內分泌和旁分泌器官，能分泌多種脂肪細胞因子，如抵抗素、脂聯素、白細胞介素_6、腫瘤壞死因子-α等。這些細胞因子共同作用于各個系統與組織，對機體的結構功能有重要的調節作用，特別是在調節機體糖脂代謝、維持能量及心血管功能的穩定、免疫應答等方面發揮著重要作用。已有研究證實，血漿低脂聯素水平與脂質代謝紊亂如高甘油二酯和低HDL-C有普遍相關性，提示脂聯素可能參與調節脂蛋白水平及其組成。另一方面有研究提出肥胖是一種低度的炎癥性疾病或炎癥狀態，巨噬細胞與脂肪細胞相互作用改變了脂肪細胞因子如抵抗素等的分泌，最終導致代謝綜合征和動脈粥樣硬化發生、發展。臨床研究亦顯示肥胖患者體內脂肪細胞增生肥大，脂肪組織內T細胞和巨噬細胞明顯增加，它們通過影響抵抗素和脂聯素的分泌，進而導致多種脂質代謝紊亂疾病。而肝臟作為體內最重要的代謝器官，在脂類的消化、吸收、分解、合成及運輸等代謝過程中均起重要作用。如肝臟是合成膽固醇的主要器官，占全身總合成量的3/4以上，其同時也可將膽固醇轉化為膽汁酸，這是膽固醇降解的最重要途徑。另外肝臟還參與除脂蛋白乳糜微粒外所有脂蛋白的合成過程，而且肝臟不但是合成脂蛋白的唯一部位同時降解脂蛋白的主要場所。考慮到脂肪組織與肝臟在機體脂質代謝中的重要地位，脂肪組織對肝臟脂質代謝的間接調控作用已日益受到人們的關注。目前調節脂質代謝紊亂藥物體外評價模型主要以單細胞為主，如游離脂肪酸誘導的人肝癌細胞株/人正常肝細胞株非酒精性脂肪肝體外模型等；以及以酶學研究為基礎的模型，如脂蛋白相關磷脂酶A2(Lp-PLA2)、烷基輔酶A、膽固醇轉移酶(ACAT)、膽固醇酯轉移蛋白(CETP)、抑制LDL氧化修飾等分子水平模型。上述體外模型并不能較為全面的模擬體內脂質代謝情況，作為藥物篩選的評價手段有所缺陷。而調節脂質代謝紊亂藥物的體內動物模型評價方法主要采用如構建家兔高脂飲食誘發高血脂模型、大鼠高脂飲食誘發非酒精性脂肪肝模型等，動物模型雖然能夠更為貼切的模擬脂質代謝異常的情況，但是周期長、花費大，不適合藥物的前期發現階段的快速評估研究。
技術實現思路
專利技術目的本專利技術提供一種能夠快速篩選降脂藥物的細胞模型。技術方案一種脂肪細胞/肝細胞共培養模型進行降脂藥物快速篩選的模型，其特征在于其包括正常脂肪細胞與肝細胞共培養細胞和炎癥脂肪細胞與肝細胞共培養細胞，上述兩種模型分別按如下步驟制得A、正常脂肪細胞與肝細胞共培養細胞 取前3代的大鼠前體脂肪細胞，用O. 25 %胰酶消化后，在Mi 11 icel I雙層培養室的下室中加入ImL密度為2 X IO5個/ml的前體脂肪細胞，待其貼壁后換為含5 μ g/mL的胰島素、200pmol/L的T3，33 μ mo I/L的生物素及10%胎牛血清的DMEM培養基進行培養，每2-3天進行一次換液，8天后認為其已分化為大鼠脂肪細胞，將培養基換為含10%胎牛血清的DMEM培養基；再將ImL肝細胞以2X IO5個/ml的密度加入Millicell上層小室，將所用的培養基均換為含10%胎牛血清的DMEM培養基，置37°C，體積分數5%的CO2培養箱內培養，每2天更換一次新鮮的培養基； B、炎癥脂肪細胞與肝細胞共培養細胞取前3代的大鼠前體脂肪細胞，用O. 25 %胰酶消化后，在Mi 11 icel I雙層培養室的下室中加入ImL密度為2 X IO5個/ml的前體脂肪細胞，待其貼壁后換為含5 μ g/mL的胰島素、200pmol/L的T3，33 μ mo I/L的生物素及10%胎牛血清的DMEM培養基進行培養，每2-3天進行一次換液，8天后認為其已分化為大鼠脂肪細胞，將培養基換為含10%胎牛血清及10ng/mL脂多糖的DMEM培養基，培養24小時后再將ImL肝細胞以2 X IO5個/ml的密度加AMillicell上層小室；將所用的培養基均換為含10%胎牛血清的DMEM培養基，置37°C，體積分數5%的CO2培養箱內培養，每2天更換一次新鮮的培養基。其中所述的Millicell雙層培養室在上層和下層之間設置的半透膜的孔徑為O. 4 μ m0上述的脂肪細胞/肝細胞共培養模型進行降脂藥物快速篩選的模型的應用，其特征在于C、在步驟A獲得的正常脂肪細胞與肝細胞共培養細胞中的脂肪細胞內，給予10-100 μ M的藥物刺激24小時后，在培養箱中37°C，5% CO2靜置培養48小時后，收集培養基及肝細胞裂解液進行指標的測定；其中檢測指標為抵抗素2-9pg/mL、HMG-CoA還原酶8-13ng/mL、脂聯素 1600_2400pg/mL、低密度脂蛋白受體 10. 5_17ng/mL ；D、在步驟B獲得的炎癥脂肪細胞與肝細胞共培養細胞中的脂肪細胞內，給予IO-IOOyM的藥物刺激24小時后，在培養箱中37°C，5% CO2靜置培養48小時后，收集培養基及肝細胞裂解液進行指標的測定；其中檢測指標為抵抗素2-8pg/mL、白介素-6200-600pg/mL、腫瘤壞死因子 a 60_190pg/mL、HMG-CoA 還原酶 8-14. 5ng/mL、脂聯素700-1400pg/mL、低密度脂蛋白受體 10_18ng/mL。有益效果I、本專利技術提供的脂肪細胞與肝細胞共培養體系，是在Millicell雙層培養系統中，肝細胞貼壁培養在上層培養室的半透膜上，脂肪細胞貼壁培養在下層培養室的底面上；該培養體系是在體外條件下模擬脂肪組織對肝臟脂質代謝的調控作用；并以藥物對細胞因子、酶和受體的影響，應用于降脂藥物的快速篩選。本專利技術提供的脂肪細胞與肝細胞共培養體系作為篩選模型，與整體動物模型相t匕，具有快速培養的優點；與單種細胞模型相比，在保持了快速培養的基礎上，不但同時提供多個調節脂質代謝的相關靶點用于篩選藥物，又模擬了體內脂肪組織對肝臟脂質代謝的調控作用，有效避免了漏篩某些通過脂肪組織間接調控肝臟脂質代謝的藥物。2、通過采用臨床降脂一線用藥辛伐他汀對該模型進行測試，我們認定藥物作用 后，脂肪細胞和肝細胞共培養體系中各因子、酶和受體含量達到上述范圍內即可認定該藥物具有調節脂質代謝紊亂的作用。附圖說明圖I為Millicell雙層培養室中共培本文檔來自技高網...
【技術保護點】
脂肪細胞/肝細胞共培養模型進行降脂藥物快速篩選的模型，其特征在于其包括正常脂肪細胞與肝細胞共培養細胞和炎癥脂肪細胞與肝細胞共培養細胞，分別按如下步驟制得：A、正常脂肪細胞與肝細胞共培養細胞取前3代的大鼠前體脂肪細胞，用0.25％胰酶消化后，在Millicell雙層培養室的下室中加入1mL密度為2×105個/ml的前體脂肪細胞，待其貼壁后換為含5μg/mL的胰島素、200pmol/L的T3，33μmol/L的生物素及10％胎牛血清的DMEM培養基進行培養，每2？3天進行一次換液，8天后將培養基換為含10％胎牛血清的DMEM培養基；再將1mL肝細胞以2×105個/ml的密度加入Millicell上層小室，將所用的培養基均換為含10％胎牛血清的DMEM培養基，置37℃，體積分數5％的CO2培養箱內培養，每2天更換一次新鮮的培養基；B、炎癥脂肪細胞與肝細胞共培養細胞取前3代的大鼠前體脂肪細胞，用0.25％胰酶消化后，在Millicell雙層培養室的下室中加入1mL密度為2×105個/ml的前體脂肪細胞，待其貼壁后換為含5μg/mL的胰島素、200pmol/L的T3，33μmol/L的生物素及10％胎牛血清的DMEM培養基進行培養，每2？3天進行一次換液，8天后將培養基換為含10％胎牛血清及10ng/mL脂多糖的DMEM培養基，培養24小時后再將1mL肝細胞以2×105個/ml的密度加入Millicell上層小室；將所用的培養基均換為含10％胎牛血清的DMEM培養基，置37℃，體積分數5％的CO2培養箱內培養，每2天更換一次新鮮的培養基；其中所述的Millicell雙層培養室在上層利下層之間設置的半透膜的孔徑為0.4μm。...
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：李妤，尚靖，陳鑫，
申請(專利權)人：中國藥科大學，
類型：發明
國別省市：
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