雙峰駝酪氨酶、編碼基因及其獲取方法技術

本發明專利技術涉及一種在雙峰駝酪氨酸酶基因、編碼蛋白及其雙峰駝酪氨酸酶基因獲取方法，本發明專利技術通過以雙峰駝組織中總RNA為模板，參考人、鼠、牛等物種的酪氨酸酶基因的同源序列設計引物，進行反轉錄PCR而獲得的新基因序列。獲得的雙峰駝酪氨酸酶基因cDNA序列見SEQ?ID?NO.1。將雙峰駝酪氨酸酶基因cDNA序列中的編碼序列(CDS)按通用密碼子翻譯成的蛋白質編碼序列見SEQ?ID?NO.2。本發明專利技術對包括SEQ?ID?NO.1在內的10個物種的十條酪氨酸酶基因的CDS序列構建了系統發生樹，結果發現：雙峰駝酪氨酸酶同牛和綿羊的進化距離最近，間接證明了所得到的序列確為雙峰駝酪氨酸酶基因。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術屬于基因工程
，特別是涉及一種在雙峰駝酪氨酸酶、編碼基因及其獲取方法。
技術介紹
酪氨酸酶(Tyrosinase，TYR)是一種75kD含銅酶，來源于胚胎神經峭細胞，是黑素代謝和兒茶酚胺的關鍵酶。Spritz等證實人TYR是一種銅結合蛋白，有銅A和銅B位點。離子銅特異性能與人TYR結合，一個位點的銅結合可以促進另一個位點的銅結合。酪氨酸酶在黑色素生物合成過程中，起著重要的催化作用，是迄今已知唯一參與黑色素生物合成的酶。研究發現，酪氨酸酶是一種具有多種生物學功能的蛋白質。主要存在于黑素細胞 中的黑素體內，絕大部分與黑素體膜相結合，只有極少數以游離的狀態存在。TYR的多肽鏈的適當折疊對銅結合及其催化活性是關鍵性的，TYR突變可中斷銅結合使其催化活性喪失。酪氨酸酶是一種獨特的具有雙重催化功能的酶。在黑色素生物合成過程中，它首先將酪氨酸羥化產生L-多巴(鄰位二羥基苯丙氨酸)；然后再將L-多巴氧化成多巴醌，多巴醌經一系列復雜反應，最后形成黑色素。酪氨酸酶的研究，在1991年，Chen，Js.用實驗證實曲酸主要通過干擾酪氨酸酶反應時所需要的氧來抑制黑色素的生成。2007年，王建新等人進行了酪氨酸酶抑制劑和激活劑的研究，表明酪氨酸酶是產生黑色素的主要限速酶，通過激活或抑制酪氨酸酶的活性可促進毛發和皮膚黑素的生成或抑制，達到烏發或皮膚增白的目的。2009年，何學民等人對黑色素與酪氨酸酶進行了研究，結果表明在體內黑色素生成過程中酪氨酸酶起了重要的催化作用，抑制酪氨酸酶活性便能達到減少色素生成的目的。在雙峰駝中，酪氨酸酶是駱駝黑素細胞中重要的蛋白，具有催化活性，又是多種物質及生物的受體，與生物醫學有著密切的關系。因此，對駱駝酪氨酸酶的研究將有助于細胞生物學和醫學的發展。
技術實現思路
本專利技術提供了一種雙峰駝酪氨酸酶雙峰駝酪氨酸酶，該酶與體內黑素細胞密切相關，其氨基酸序列如下述(a)或(b)所示(a) SEQ ID NO. 2 所示序列；(b)在(a)限定的氨基酸序列中經過取代、缺失或/和疊加一個或多個氨基酸衍生得到的，且與(a)編碼蛋白質具有相同功能的保守性變異多肽、活性片段或活性衍生物的氨基酸序列。本專利技術還提供了一種雙峰駝酪氨酸酶編碼基因，其核苷酸序列如下述(a)或(b)所示(a) SEQ ID NO. I 所示序列；(b)由堿基簡并或/和替代衍生的與(a)所述核苷酸序列90%以上同源性，且與(a)編碼相同功能蛋白質的序列。本專利技術還提供了一種雙峰駝酪氨酸酶編碼基因的獲取方法，該方法包括步驟(I)組織分離(Isolation) ； (2)總RNA的分離(Total RNA isolation):包括①提取RNA的準備工作組織總RNA提取組織總RNA的鑒定。(3)全長cDNA的克隆(Cloning ofFull-length cDNA)包括①引物設計及合成RT-PCR擴增；③克隆和測序，其中PCR引物的正向引物為SEQ ID NO. 3和反向引物為SEQ ID NO. 4， 其序列信息如下SEQ ID NO. 3 :5’ -ATGCTCCTGGCTGCTTTGTAC-3’，SEQ ID NO. 4 :Oligo dT。上述總RNA的分離是將雙峰駝耳部組織液放入裝有Trizol的勻漿器管中勻漿，離心分離，吸取上清液，在15-30°C溫育5分鐘，加氯仿，劇烈震蕩，繼續在15-30°C溫育2_3分鐘，再次離心分離，吸取上清液，加異丙醇混合均勻，后15-30°C溫育10分鐘，離心分離，所得沉淀物加75%乙醇洗滌，離心分離后自然干燥或真空干燥得到總RNA。分離提取后的總RNA用分光光度計測定RNA含量和用瓊脂糖凝膠電泳分析RNA的質量。上述反轉錄PCR按照大連寶生物反轉錄試劑盒的要求進行反轉錄。上述克隆和測序包括PCR擴增片段的回收、回收片段同T載體的連接、質粒的轉化、轉化菌落的PCR鑒定與培養、質粒的回收、質粒的酶切鑒定和重組質粒的測序。上述PCR擴增片段的回收按照上海華舜小量膠回收試劑盒的要求進行。上述回收片段同T載體的連接用TaKaRa pMD18_T Vector試劑盒。上述質粒的轉化為將感受態細胞加入到回收片段同T載體的連接產物中，冰浴30分鐘，然后在42°C水浴熱應激90秒鐘，立即置入冰浴中2分鐘，加液體LB培養基，37°C復活50分鐘，后涂布于含有氨芐青霉的LB平板上，37°C恒溫培養10-15小時。上述轉化菌落的PCR鑒定與培養為挑選轉化培養的單菌落，放入到加有PCR反應液的EP管中晃動，使單菌落充當模板；用獲得該片段的PCR條件進行擴增，PCR產物同Marker 一起進行瓊脂糖凝膠電泳，鑒別T載體上是否含有目的片段；若得到目的片段，可挑取在LB平板上的與之對應的單菌落，放入含有的青霉素鈉LB液體培養基中，37°C過夜搖菌培養，用于質粒回收。上述質粒的回收用上海華舜小量質粒抽提純化試劑盒實現。上述質粒的酶切鑒定采用雙酶切法鑒定，選擇內切酶Bam H I和Hin d III。本專利技術在提供了雙峰駝酪氨酸酶基因的cDNA序列和蛋白編碼序列基礎上，將人、鼠、牛等不同物種酪氨酸酶基因的CDS序列和氨基酸序列進行同源性比較；對包括雙峰駝在內的10個物種的十個酪氨酸酶基因的CDS序列構建了系統發生樹。本專利技術中的雙峰駝酪氨酸酶基因的cDNA序列是通過以雙峰駝組織中總RNA為模板，參考人、鼠、牛等物種的酪氨酸酶基因的同源序列設計引物，進行反轉錄PCR而獲得的新基因序列。獲得的雙峰駝酪氨酸酶基因cDNA序列見SEQ ID NO. I。將雙峰駝酪氨酸酶基因cDNA序列中的編碼序列(⑶S)按通用密碼子翻譯成的蛋白質編碼序列見SEQ ID NO. 2。在SEQ ID NO. I中，RT-PCR產物長度為1806bp，電泳結果見圖1，其中31-33位為起始密碼子ATG，1621-1623位為終止密碼子TAA，31-1623位為編碼蛋白質區域(⑶S)。在SEQ ID NO. 1，雙峰駝酪氨酸酶基因編碼530個氨基酸。雙峰駝與牛(AAL02331. 2)、綿羊(NP_001123499. I)的酪氨酸酶核酸序列具有89%的相似性。雙峰駝和人、鼠、牛等動物用Clustal X中對齊的酪氨酸酶基因編碼氨基酸序列同源性比較結果見圖2。對包括SEQ ID NO. I在內的10個物種的十條酪氨酸酶基因的⑶S序列構建了系統發生樹，結果發現雙峰駝酪氨酸酶同牛和綿羊的進化距離最近，間接證明了所得到的序列確為雙峰駝酪氨酸酶基因。本專利技術所得到的酪氨酸酶蛋白的基因序列和該蛋白結構的數據可用于研究其在黑素合成的下游途徑中的重要作用，為闡明雙峰駝毛色生成機理和未來產生人為控制的商用價值的毛色提供理論基礎和依據，并能夠為其它哺乳動物的皮膚與毛發色素形成機理研究奠定一定的生物學基礎。附圖說明圖I為雙峰駝酪氨酸酶基因RT-PCR產物電泳圖； 圖2為構建系統發生樹所用酪氨酸酶氨基酸同源性比較；圖3為不同物種酪氨酸酶氨基酸序列系統進化樹。具體實施例方式下面實施例用于對本專利技術的進一步說明，但不用來限制本專利技術的保護范圍。實施例I :雙峰駝酪氨酸酶基因cDNA序列的克隆I.組織分離(Isolation)從內蒙古阿拉善盟雙峰駝，快速采得樣品，將耳部組織樣迅速放入液氮中本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種雙峰駝酪氨酸酶，其氨基酸序列如下述(a)或(b)所示：(a)SEQ？ID？NO.2所示序列；(b)在(a)限定的氨基酸序列中經過取代、缺失或／和疊加一個或多個氨基酸衍生得到的，且與(a)編碼蛋白質具有相同功能的保守性變異多肽、活性片段或活性衍生物的氨基酸序列。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：張文彬，吉日木圖，
申請(專利權)人：張文彬，
類型：發明
國別省市：