轉基因非人動物及其用途制造技術

本發明專利技術總的涉及轉基因構建體，包含轉基因構建體的轉基因非人動物及其產生的方法，以及使用包含轉基因構建體的轉基因非人動物的方法。本發明專利技術的一個實施方案涉及無創地在全動物、組織切片或天然細胞中利用在配體結合至GPCR受體后對通道調節有應答的、包含生物發光轉基因報告系統的轉基因模型中檢測GPCR配體活化的方法。

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】
本專利技術總的涉及轉基因構建體，包含轉基因構建體的轉基因非人動物及其產生的方法，以及使用包含轉基因構建體的轉基因非人動物的方法。本專利技術的一個實施方案涉及無創地在全動物、組織切片或天然細胞中利用在配體結合至GPCR受體后對通道調節有應答的、包含生物發光轉基因報告系統的轉基因模型檢測GPCR配體的方法。
技術介紹
在藥物研發過程中，淘汰率很高，五種化合物中只有一種能通過美國食品藥品監督管理局(FDA)的批準(DiMasi, JA, et al, J Health Econ 22，151-185，2003)。此外，盡管投資大大增加了，新藥物的引入在過去30年中保持相對穩定，新藥類別中，每年只有兩到三個有進展，最終能夠上市(Lindsay MA, Nature Rev Drug Discovery, 2，831-838，2003)。 應用于藥物研發初始階段的分子和功能性成像可提供生物活性的證據并證實推定的藥物對其預期的目標有效。因此，人們對在分子成像技術投資很有希望能夠促進藥物研發過程(Rudin M, Progress in Drug Res vol 62)。分子成像技術相對于更傳統的讀數方法的優勢在于，它們可在完整無損的生物體中進行，并具有足夠的空間和時間分辨率來研究體內的生物過程。此外，該技術還允許在不同的時間點對同一生物模型進行重復、無創、一致且相對自動化的研究，因此增加了縱向研究的統計效力，并減少所需動物的數目，因而降低了藥物研究的成本。分子成像分子成像是指通過多學科(細胞和分子生物學、化學、醫學、藥學、物理學、生物信息學和工程學)方法的綜合，在活體生物中在細胞和亞細胞水平上利用并整合成像技術來評估特定的分子過程(Massoud T. F·，Genes Dev. 17:545-580，2003)。遺傳工程的出現已經給應用科學(包括例如藥物研發)帶來了重大的變化。同樣地，動物成像技術的研發和利用為臨床前研究提供了新的手段(Maggie A. and CianaP.，Nat. Rev. Drug Discov. 4，249-255，2005)。由于對生理事件進行實時定量的困難，因此傳統上動物模型的使用很不方便。這些年來，已經研發出新的成像技術來克服這一困難，所述技術例如磁共振成像(MRI)和正電子發射體層照相術(PET)。最近，基于螢光素酶(即螢火蟲的發光酶)的體內表達的生物發光成像已被用于無創檢測。分子成像生物發光體內生物發光成像(BLI)是一種基于檢測細胞或組織光發射的靈敏工具。報告基因的使用使得有可能通過體內成像方法在活體動物中分析特定細胞和生物過程。生物發光，即用酶法催化活體生物產生可見光，在很多非哺乳動物物種中是一種天然發生的現象(Contag, C. H. , et al, Mol. Microbiol. 18:593-603，1995)。螢光素酶是催化底物氧化以釋放光子的酶(Greer L. F.，III，Luminescence 17:43-74, 2002) 對北美螢火蟲的生物發光研究最為廣泛。螢火蟲螢光素酶基因((Iuc)表達產生螢光素酶，它將底物D-螢光素轉化成非反應性氧化螢光素，結果在562nm產生綠色發光。由于哺乳動物組織并不能天然地產生生物發光，體內BLI具有相當大的吸引力，因為產生的圖像只有很小的背景信號。BLI要求利用由選擇的基因啟動子(其從組成上啟動發光報告基因)所控制的生物發光報告基因所組成的表達盒，對細胞或組織進行基因工程處理(圖3)。為了誘發發光，例如螢光素的底物可通過腦室內(icv)、靜脈內(iv)、腹膜內(ip)或皮下(sq)注射給藥。螢光素酶發射的光可穿透幾毫米到幾厘米的組織深度，但是，每深入組織一厘米，光子強度則降低 10 倍(Contag, C. H. , et al, Mol. Microbiol. 18:593-603，1995)。必須使用靈敏的光檢測儀器來檢測體內生物發光。檢測器測量每單位面積發射的光子數目。利用電荷耦合裝置照相機可檢測波長在400和IOOOnm之間的低強度光，該照相機將撞擊硅晶片的光子轉換成電子(Spibey CP et al electrophoresis 22:829-836,2001)。軟件可將電子信號轉換成二維圖像。軟件還可以對發射光的強度(撞擊檢測器的發射光子的數目)進行定量，并將這些數值轉換成偽色(pseudocolor)圖形或灰度圖像(圖2A和2B)。實際的數據是以光子測量的，但是，偽色圖像允許研究人員進行快速視覺解釋。對于更細微的差另O，則可能需要在感興趣的區域進行定量測量。使用冷卻的電荷耦合裝置(CCD)照相機可降低熱噪音，光密閉機箱可使螢光素酶產生的光實現最佳視覺化和定量(Contag C. H. andBachmann, Μ. H. , Annu. Rev. Biomed. Eng. 4:235-260，2002)。 有用的是，將螢光素酶圖像疊加到另一種類型的圖像上，所述圖像例如發射信號解剖位置的自動繪像或射線照片(圖2B)。軟件可疊加圖像用于可視化和解釋。通過動物基因工程和分子成像技術的結合，有可能對活體動物體內的特定分子過程進行動態研究。這一方法可能潛在地影響臨床前研究方案，因此正在廣泛地改變醫學領域的各個方面(Maggie A. Trends Pharmacolo. Sci 25, 337-342，2004)。G-蛋白偶聯受體(GPCRs)-GPCRs作為藥物靶點GPCRs組成了一個很大的細胞表面受體的超家族，可根據其共有的形態結構分類為100多個亞家族，GPCR亦稱為七跨膜(7TM)受體。在制藥行業，GPCR是最經常涉及的藥物靶點。所有的上市處方藥物中，大約有30%以GPCR為靶點，使得這一蛋白質家族成為藥學上最成功的一類靶點(Jacoby, E; Chem. Med. Chem.，1:761-782，2006)。GPCR和其細胞外配體之間的相互作用已被證明是治療劑的一個很有吸引力的干擾點。由于這一原因，制藥行業已經研發了用于發現生物化學藥物的分析方法來研究這些配體-GPCR相互作用。活化的GPCR與異源三聚體G蛋白的相互作用催化鳥苷二磷酸(⑶P)與鳥苷三磷酸(GTP)的交換，使之能與幾個下游效應子相互作用(Cabrera-VeraT. M.，Endocr. Rev. 24:765-781, 2003)。下游信號取決于所研究GPCR所優選的G-α同種型。G- a q/11家族蛋白質刺激磷脂酶C(PLC)，而G- a i/0和G- a s家族的代表性蛋白質主要調節腺苷酸環化酶(AC)的活性。如果所研究的GPCR通過PLC發送信號，那么，最廣泛應用的基于報告基因的測定GPCR活化的技術為一種鈣(Ca+2)釋放分析，或是利用Ca+2敏感的熒光團以熒光形式測量(Sullivan E, Methods Mol. Biol. 114:125-133，1999)，或利用水母發光蛋白和一個化學發光底物以發光的形式測量(Dupriez V. J. , ReceptorsChannels 8:319-330, 2002) 如果所研究的GPCR通過AC發送信號，那么，則可以利用各種檢測技術測定胞衆環磷酸本文檔來自技高網...

【技術保護點】

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】...

【專利技術屬性】
技術研發人員：H德雷斯勒，KD埃科諾米德斯，龐震，HG波利特斯，
申請(專利權)人：賽諾菲，
類型：
國別省市：