利用競爭性引物的目標堿基序列的檢測方法技術

一種具有多態性堿基的目標堿基序列的檢測方法，該檢測方法包括：（a）在具有由包括目標堿基序列的堿基序列組成的目標核酸的核酸試樣中，添加至少一種檢測用引物、至少一種競爭性引物以及至少一種共用引物的步驟；（b）使所述檢測用引物與所述競爭性引物通過競爭與所述目標核酸進行退火，從而合成延伸產物A的步驟、（c）使通過所述步驟（b）或后述步驟（d）而得到的所述延伸產物A與所述共用引物進行退火，從而合成延伸產物B的步驟、（d）使通過所述步驟（c）得到的延伸產物B與所述檢測用引物或所述競爭性引物進行退火，從而合成延伸產物A的步驟以及（e）檢測所述延伸產物A或B的步驟。

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】
本專利技術涉及具有多態性堿基的目標堿基序列的檢測方法以及用于所述方法的試劑盒。更詳細地說，涉及一種通過引物的競爭高精度地檢測出目標堿基序列的檢測方法、以及用于所述方法的試劑盒。本專利技術基于2010年3月24日向日本專利局提出的申請號為特愿2010-68490的專利技術專利主張優先權，并將該內容引用于本申請。
技術介紹
近年來，根據全球性的人類基因組解析，已確定出31億個堿基對序列，且確定出人類基因數量大概為3 4萬個。 人類的不同個體之間存在著不同的堿基序列，若該堿基序列以特定人群1%以上的頻率存在，則稱為基因多態。其中，對于基因喊基序列之間的不同點僅在于單個喊基的單核苷酸多態性(Single Nucleotide Polymorphism, SNP)而言,被認為其與各種疾病的發生具有相關性。例如，人類遺傳病的病因，被認為是一個基因中單個堿基的差異。另外，生活方式病或癌癥等疾病，被認為是受到了多個基因中單個堿基不同的影響而發生。由此，認為SNP的解析在藥物靶標的探索或副作可的預見性等的藥品開發方面非常有效。因此，SNP的解析作為全球性的重大課題而被向前推進。作為藥物效果或副作用程度因人而異的原因之一，可舉出每個人的與藥物代謝相關的酶群的不同。最近還確定了這種差異也是因基因上的略小差異而引起。因此，提出了通過預先對患者的基因進行分析后，選出對患者最適宜的藥并給予患者的方法。進而，不僅是單基因遺傳病(monogenic disease),對多因子疾病(multifactorial disorder),基因診斷的意義也正在得到迅速提高。另外，對于以病原細菌或病毒為目標的藥物效果來說，即便是相同種類，在每個個體之間也存在差異，這些差異大多數是由于每個個體基因上的細微差異產生的。這種作為外來因子的病原細菌或病毒的基因診斷，預計今后也增加為檢測對象。如此地，在后基因時代，能夠檢測出人類或病原微生物基因上的微小差異、尤其是能夠檢測出單個堿基的差異是一件非常重要的事情，而且預計今后會越來越重要。至今，對檢測出堿基序列中的細微差異、尤其是對單堿基差異的檢測方法進行了各種研究(參照非專利文獻廣2)。然而，為了使檢測達到實用水平，要求該方法為成本低、方法簡便、檢測時間短以及檢測結果的準確度等方面都均非常優異的檢測方法。但到現在為止，還沒有能夠滿足上述要求的檢測方法。在檢測基因的細微差異、尤其是檢測單堿基差異時，通常來講，試樣中僅含有少量的作為目標的基因片段。此時，必須通過某些方法，預先對目標基因進行擴增。作為這種基因擴增法，例如、可舉出聚合酶鏈反應(PCR, Polymerase Chain Reaction)法。通常來說，為了檢測出目標基因中的單個堿基差異，需要進行兩個步驟，即基因擴增步驟和檢測擴增基因中的單個堿基差異的步驟(參照非專利文獻2)。然而，對于需要經過兩個步驟的檢測方法來說，由于包括多個步驟，因此處理起來比較復雜。為了改善這種包括兩個步驟的檢測方法的復雜性，例如，報道了采用附著有熒光色素和淬滅劑的探針的TaqMan法(參照非專利文獻3)、或利用通過質譜儀進行DNA質量分析的基體輔助激光解吸/電離飛行時間質譜(MALDI-T0F/MS)法(參照非專利文獻4)等。另夕卜，作為不需要進行基因擴增的檢測方法，報道了采用對DNA結構進行識別并切割的酶侵入(invader)法(參照非專利文獻5)。然而，若要實施這些方法，仍需要高成本，而且探針的設計也很復雜。另一方面，報道了同時進行基因擴增和單堿基識別的方法(參照非專利文獻6)。該方法是，在DNA聚合酶的延伸反應中，利用了延伸反應的發生取決于引物的3’末端是否與試樣中的模板DNA相互補(以下稱為匹配)的原理的方法。即，在用于PCR反應的一對引物組中，如果將一引物設計成在3’末端具有與單堿基多態相互補的堿基的引物時，若引物與模板完全匹配，則發生延伸反應，且在與另一個引物之間發生擴增反應。但是，如果一個引物與模板之間存在單堿基的不匹配現象，則該引物難以發生延伸反應，且在與另一個引物之間也難以發生擴增反應。由此，根據通過擴增反應而產生的擴增產物量，能夠進行單堿基·的識別。根據該方法，進行擴增反應后，無需進行用于識別單堿基的進一步操作。然而,該方法中，反應容易受到反應條件例如模板量、溫度、引物量、或用作反應底物的dNTP濃度等的影響。因此經常獲得有再現性的數據并不容易。作為其他方法，例如研究過在引物3’末端附近引入人工變異(與模板不匹配的堿基)的方法(參照非專利文獻7)。然而，在該方法中，為了引物的優化也需要付出一定的勞動，且識別精度也受到試樣品質的影響。為了解決這些問題，提出了一種使至少兩種被熒光色素等標記的引物發生競爭的方法(參照專利文獻廣4)。如專利文獻f 3所記載，被稱為等位基因特異性PCR (ASP-PCR)的檢測方法是利用下述特性使引物的3’末端或末端附近與需要檢測的堿基位置相互補、且與試樣中的目標核酸堿基相匹配時發生延伸反應，不匹配時難以發生延伸反應的特性來進行檢測。進行等位基因特異性PCR反應時，可知在使兩個以上的等位基因特異性引物發生競爭的狀態下，其堿基識別精度高于對各個等位基因特異性引物分別進行擴增時的堿基識別精度(非專利文獻8)。其原因在于，當存在與需要檢測的等位基因不同的等位基因時，與不同的等位基因相匹配的引物優先與目標堿基序列結合，從而抑制了需要檢測的引物的非特異性延伸反應。而且，由于與不同的等位基因相匹配的引物進行有效的延伸反應，進而消耗掉延伸反應所需的材料，因此，也能夠抑制通過與需要檢測的等位基因不匹配的引物所引起的引物二聚體的生成。如此的使引物之間發生競爭的檢測方法稱為競爭性寡核苷酸引發(COP, Competitive Oligonucleotide Priming),在專利文獻 I 4 中米用 COP。專利文獻I所提出的方法是利用了當相對于目標核酸使用不匹配堿基數量不同的多個競爭性引物時，不匹配堿基數量少的競爭性引物與目標核酸容易形成雙鏈的性質的方法，該方法是簡便地檢測出目標核酸中的單堿基變異的好方法。然而，在該方法中，進行SNP解析時有可能發生假陽性反應。其原因認為，由于只針對目標核酸中的單堿基變異而設計競爭性引物，因此，對不匹配堿基數量多的競爭性引物延伸的抑制能力不夠充分的緣故。用于等位基因特異性PCR反應的等位基因特異引物中，其與目標核酸在3’末端附近的雙鏈的穩定性非常重要，在3’末端附近，以除了需要識別的堿基以外，其它堿基與目標核酸不形成互補的方式進行設置，能夠進一步提高堿基識別能力。在專利文獻2的SNP檢測方法中，為了減少存在于專利文獻I中的假陽性問題，在競爭性引物的3’末端引入用于識別SNP的堿基，而且在3’末端的第2飛個堿基中的至少一個堿基上引入人工變異。另外，由專利文獻3所提出的堿基多態檢測方法中，在競爭性引物的3’末端第5個堿基上引入人工變異。專利文獻2 3所提出的方法是在競爭性引物之間的相同位置上引入相同變異的方法，該方法利用了下述特性如果引物的3’末端附近與目標核酸相匹配，則能夠有效地進行延伸反應，不匹配堿基數量越多，延伸效率越低的性質。另外，隨著不匹配堿基的增加， 引物與目標核酸之間的雙鏈在整體上變得不穩定，這本文檔來自技高網...

【技術保護點】

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】...

【專利技術屬性】
技術研發人員：牧野洋一，山根明男，中山雅人，
申請(專利權)人：凸版印刷株式會社，
類型：
國別省市：