本發(fā)明專利技術(shù)公開了用于基因缺失分析的方法、探針組、試劑盒和組合物。在某些實(shí)施方案中，方法涉及制備缺失分析使用的探針、進(jìn)行缺失分析或者優(yōu)化缺失分析。在某些實(shí)施方案中，方法和探針組可以提供下降的人為缺失發(fā)生率，例如分析經(jīng)過人為截?cái)嗟臉悠窌r。在某些實(shí)施方案中，方法和探針組可以區(qū)分小的和大的缺失。
【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
【國外來華專利技術(shù)】用于經(jīng)熒光原位雜交檢測腫瘤抑制基因缺失的方法、探針組和試劑盒本申請要求2010年3月15日提交的美國臨時專利申請61/313，916和2010年3月15日提交的加拿大專利申請2，696，545的權(quán)益，兩份申請的全部內(nèi)容均通過引用并入本文。本專利技術(shù)涉及在檢測腫瘤抑制基因的缺失的分析中使用的方法、探針組和試劑盒，以及制備所述探針組和優(yōu)化所述分析的方法。本專利技術(shù)的實(shí)施方案還包括檢測樣品中的染色體事件，比如缺失、擴(kuò)增、轉(zhuǎn)位和其它染色體事件的方法，其中所述樣品是比如血液或?qū)嶓w瘤以及甲醛固定石蠟包埋(FFPE)薄切片、細(xì)針抽吸活檢(FNA)、抹片等。在某些實(shí)施方案中，染色體事件涉及諸如腫瘤抑制、癌基因相關(guān)的和/或原癌基因的基因。了解癌細(xì)胞或原癌細(xì)胞是否發(fā)生率腫瘤抑制基因的缺失對于提高診斷和/或預(yù) 后準(zhǔn)確性或者治療方法的選擇一般來說很有用。被懷疑是癌細(xì)胞或原癌細(xì)胞的樣品，比如來自懷疑是癌或原癌生長(包括腫瘤(081 ^1'、1^0 1&81118)、增生等)的樣品經(jīng)常以例如固定的保存樣品(比如甲醛固定石蠟包埋(FFPE)樣品)的形式供實(shí)驗(yàn)室分析。顯然，這類樣品的保存也使得可以進(jìn)行追溯性研究，給未來預(yù)后和治療選擇提供信息。腫瘤抑制基因的缺失可以通過熒光原位雜交(FISH)在FFPE樣品中檢測分析，所述技術(shù)中樣品與目標(biāo)基因的探針以及通常還有至少一個對照探針和/或核復(fù)染進(jìn)行接觸。腫瘤抑制基因的例子包括PTEN、p53、pl6(又稱為CDKN2A)、RBU DCC、BRCAU BRCA2和APC。可以利用熒光使探針可見，并且分析產(chǎn)生的FISH信號來確定是否存在缺失。來自實(shí)體生長物的樣品以固定的保存樣品提供時，通常是采取幾個微米厚的切片。因此，在樣品切片過程中有可能切掉了含有腫瘤抑制基因的那部分細(xì)胞核。這種現(xiàn)象經(jīng)常造成核截?cái)喱F(xiàn)象，導(dǎo)致實(shí)際上不帶有腫瘤抑制基因缺失的細(xì)胞看上去至少失去了一個拷貝的腫瘤抑制基因。截?cái)喱F(xiàn)象可能發(fā)生在間期細(xì)胞，這時染色體凝集并分布在構(gòu)成常規(guī)病理學(xué)組織切片的球形核的三維空間內(nèi)。在分裂中期細(xì)胞中廣46條染色體處于扁平、桿狀的線性結(jié)構(gòu)，一般可以在不被截?cái)嗟那闆r下沉積到顯微鏡載片的表面。在臨床樣品(包括來自疑似癌或原癌實(shí)體生長的樣品，比如實(shí)體瘤)中，多數(shù)細(xì)胞的確通常處于間期。代表性的分裂中期細(xì)胞樣品很難或者不可能從用于追溯性分析的樣品，或者從患者中獲得，固定、保存并送到異地實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行分析。因此核截?cái)喱F(xiàn)象負(fù)面影響基于FISH的腫瘤抑制基因缺失分析的表現(xiàn)。為了防止假陽性(即發(fā)生了腫瘤抑制缺失的不正確結(jié)論)的可能性，可以給表觀缺失發(fā)生率設(shè)置一個最低閾值，其中當(dāng)表觀缺失發(fā)生率不超過該閾值時，結(jié)果被認(rèn)為是陰性或最多不確定的。所述閾值可以基于利用對照細(xì)胞估計(jì)的人為缺失發(fā)生率；觀察到的缺失水平要被認(rèn)為是顯著的，可能需要超過人為缺失發(fā)生率例如人為缺失發(fā)生率的三個標(biāo)準(zhǔn)差。但是使用這種最小閾值要以靈敏度為代價，因?yàn)槔绠?dāng)樣品中含有缺失的細(xì)胞的數(shù)量較低或者當(dāng)樣品中細(xì)胞是遺傳型異質(zhì)的時，很難或者不可能確定缺失。同源性憐酸酶-張力蛋白(phosphataseand tensin homolog, PTEN)是人體中由PTEN基因編碼的一種蛋白質(zhì)。許多癌癥類型(Cristofano AD et al.，PTEN isessential for embryonic development and tumour suppression, NatureGenetics1998; 19:348-355)和被稱為考登綜合征(Cowden syndrome)的遺傳學(xué)發(fā)育缺陷(MarshDJ et al. , Germline PTEN mutations in Cowdensyndrome-Iike families, J. Med.Genet. 1998;35:881-885)中觀察到過該腫瘤抑制基因的失活。近年來，利用與PTEN雜交的368kb探針發(fā)現(xiàn)PTEN基因座周圍368kb或以上的基因組缺失在前列腺癌中很常見(Yoshimoto et al. , Cancer Genetics and Cytogenetics 2006;169:128-137),并且它們的存在帶來不利的預(yù)后(Yoshimoto et al. , British Journal of Cancer2007;97:678-685;Yoshimoto et al. ,Modern Pathology 2008;21:1451-1460)。因此，準(zhǔn)確的腫瘤抑制基因(比如PTEN)缺失的分析法在臨床上有重要意義。此外，需要更高的通過大小來區(qū)分缺失的檢測能力。有純合PTEN缺失的前列腺腫瘤，其中至少一個缺失事件刪除了超過PTEN及其直接的周邊的染色體區(qū)域，更有可能是轉(zhuǎn)移性腫瘤或者發(fā)生轉(zhuǎn)移的可能性增加。因此，用于這類檢測的探針組和方法對預(yù)后和做出治療方面的決定，以及對前列腺癌的進(jìn)展和分類進(jìn)行進(jìn)一步研究是有用的。因此，需要用于檢測腫瘤抑制基因(比如，例如PTEN)缺失分析的方法、探針組和試劑盒，所述分析能夠減少核截?cái)喱F(xiàn)象的發(fā)生率；以及制備這類探針組和優(yōu)化所述分析的 方法。本專利技術(shù)的方法和組合物部分基于這樣的發(fā)現(xiàn)，即通過提供能夠減少誤差(比如截?cái)喱F(xiàn)象)來源的探針組可以使基于FISH的腫瘤抑制缺失分析的性能(特異性、靈敏度和/或統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性)得以優(yōu)化。所述探針組包含至少第一側(cè)翼探針、目標(biāo)探針和第二側(cè)翼探針，它們分別與位于腫瘤抑制基因的著絲粒方向、腫瘤抑制基因或者附近，以及端粒方向的位點(diǎn)雜交。腫瘤抑制基因在某些類型的癌或原癌細(xì)胞中易于發(fā)生缺失；例如至少在前列腺腫瘤中PTEN很容易發(fā)生缺失。第一或第二側(cè)翼探針和目標(biāo)探針之間的距離在細(xì)胞遺傳學(xué)尺度來說可能較短，例如，500kb-10或20Mb的距離。在某些實(shí)施方案中，第一和第二側(cè)翼探針的雜交位點(diǎn)與目標(biāo)探針的雜交位點(diǎn)分別被第一和任選的第二邊界區(qū)隔開(例如，靠近這些部位的基因組結(jié)構(gòu)特征，比如節(jié)段性重復(fù)和拷貝數(shù)差異；詳細(xì)討論見下文)。第一和第二側(cè)翼探針的雜交位點(diǎn)可以分別位于第一和第二(如果有的話)邊界區(qū)或者與所述區(qū)域從細(xì)胞遺傳學(xué)角度來說鄰近。所述探針組由于它們的雜交位點(diǎn)的位置，可以使基于FISH的基因變異分析的表現(xiàn)得以優(yōu)化。將側(cè)翼探針定位在目標(biāo)探針的雜交位點(diǎn)附近和/或與邊界區(qū)相鄰，但相對邊界區(qū)在分析目標(biāo)的遠(yuǎn)端，可以起到減少不確定結(jié)果和/或包括由核截?cái)嘣斐傻募訇栃缘娜藶橛^察結(jié)果的作用。因此，本公開提供了進(jìn)行基于FISH的分析的方法，制備用于基于FISH的腫瘤抑制因子缺失分析的探針的方法，和測量核截?cái)嘣诨贔ISH的腫瘤抑制因子分析中的影響的方法。本公開還提供了可以在基于FISH的腫瘤抑制因子缺失分析中使用的探針組和組合物以及包含所述探針的試劑盒。專利技術(shù)的一個實(shí)施方案是基于FISH的腫瘤抑制因子缺失分析中使用的探針組的制備方法，所述方法包括(a)識別染色體上的至少一個邊界區(qū)，所述染色體包含腫瘤抑制基因，其中所述至少一個邊界區(qū)包含位于腫瘤抑制基因著絲粒方向的第一邊界區(qū)；(b)提供至少一個第一側(cè)翼探針，所述探針與第一邊界區(qū)內(nèi)的核酸序列雜交；或者與相對第一邊界區(qū)而言位于腫瘤抑制基因遠(yuǎn)端的核酸序列雜交；(c)提供至少一個第二側(cè)翼探針，所述探針與位于本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
【技術(shù)特征摘要】
【國外來華專利技術(shù)】...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：JA斯奎爾，M約希默托，
申請(專利權(quán))人：金斯頓女王大學(xué)，金斯頓總醫(yī)院，
類型：
國別省市：
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