本發(fā)明專利技術(shù)涉及一株鴨出血性卵巢炎病毒（Duck?hemorrhagic?ovaritis,DHOV）。從臨床發(fā)病蛋鴨的組織病料中用SPF源雞胚成纖維細分離到一株DHOV-JN，該分離株能在CEF上增殖并能致其產(chǎn)生典型的細胞病變，亦能在MDCK、Vero、BHK-21、ST和Marc-145單層細胞上進行增殖并出現(xiàn)較為一致的CPE，用CEF測得分離株效價為105.5TCID50/0.1mL；該分離株屬黃病毒科、黃病屬、恩塔亞病毒群的成員；該毒株可以此研究為基礎(chǔ)開發(fā)相應的RT-PCR檢測/診斷方法（試劑），也可研制用于本病臨床預防用疫苗等生物制品。
【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及一株鴨出血性卵巢炎病毒。該病毒分離自一種新的鴨病。屬動物病毒學領(lǐng)域。
技術(shù)介紹
自2010年4月初以來，我國浙江、江蘇、山東、福建、河北、北京等省份的種鴨、蛋鴨發(fā)生一種以產(chǎn)蛋率急速下降、甚至停產(chǎn)及不同程度死亡為特征的疫病，俗稱種(蛋)鴨產(chǎn)蛋驟降、卵巢出血癥，引起此病的病毒最初命名為鴨黃病毒(Duck flavivirusvirus, DFV),現(xiàn)基本統(tǒng)一命名為鴨出血性卵巢炎病毒(Duck hemorrhagic hvaritis virus，DH0V)。各品種蛋鴨、種鴨等均有發(fā)生，但主要見于開產(chǎn)蛋鴨。產(chǎn)蛋鴨發(fā)病后出現(xiàn)長時間(4(T60d)的產(chǎn)蛋率低下，恢復后所產(chǎn)種蛋的受精率和孵化率出現(xiàn)下降。發(fā)病鴨采食量顯著下降，拉綠色稀便，精神沉郁，扎堆，羽毛逆立，眼球深陷，目光呆滯，體重減輕。少量病鴨出現(xiàn)站立不穩(wěn)、震顫，行走困難和姿勢異常。主要病變?yōu)槌鲅月殉惭住㈤g質(zhì)性肝炎和非化膿性腦炎。該病近期成為危害中國養(yǎng)鴨業(yè)的重要疫病之一。產(chǎn)蛋率高的鴨群患病后4 5(1從產(chǎn)蛋高峰或高產(chǎn)蛋率迅速下降至209Γ30%，嚴重的于發(fā)病后7d左右停產(chǎn)；剛開產(chǎn)種(蛋)鴨產(chǎn)蛋率上升緩慢或減蛋，長時間低產(chǎn)蛋率或無產(chǎn)蛋高峰出現(xiàn)。不同地區(qū)、不同品種鴨群發(fā)病率高低不一，群內(nèi)發(fā)病率幾乎100%，病死率為09Γ12%。國內(nèi)外研究資料，黃病毒一般能在鼠腦、C6/36、BHK-21、Vero等組織或細胞上進行增殖，近年來，也有人接種9到10日齡雞胚或鴨胚尿囊液進行病毒分離增殖。考慮到細胞來源穩(wěn)定、質(zhì)量可控、無外源病毒污染，我們選定SPF源雞胚成纖維細胞(CEF)作為分離這種病毒的唯一細胞系。眾所周知，CEF細胞來源于SPF雞胚，其供體背景清楚(不含任何病源)、制備工藝成熟、方法簡單、對禽源病毒較為敏感。同時，SPF級鴨胚來源有限，而用SPF雞胚制備的CEF繁殖病毒，其每胚產(chǎn)量是SPF雞胚的10倍左右，且效價較高，在雞胚成纖維細胞繁殖的效價明顯高于雞胚和鴨胚上的效價。因此，我們選用CEF細胞用于這種病毒的分離培養(yǎng)，并取得成功，并對分離株進行了系統(tǒng)鑒定和E基因測序分析。由于是新發(fā)傳染病，人們對鴨出血性卵巢炎病毒(Duck hemorrhagic hvaritisvirus, DHOV)的分離鑒定、生物學特性及主要抗原基因特征研究尚有較大的空白。
技術(shù)實現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的是由病死蛋鴨體內(nèi)分離病原、并對其分離物進行鑒定和利用。本專利技術(shù)采用的技術(shù)方案是采集病死鴨肝臟、卵巢等病變組織經(jīng)研磨、離心、濾過后進行病原分離鑒定，對所獲得的病毒分離株進行細胞培養(yǎng)特點、電鏡觀察、效價測定、疑似病原RT-PCR/PCR檢測及測序、核酸型鑒定、理化特性鑒定、血凝性測定、血清中和試驗、動物試驗作進一步的鑒定。I.本研究通過對發(fā)病樣品處理，接種原代細胞CEF和MDCK等哺乳動物傳代細胞，相繼獲得具有同一種CPE表現(xiàn)的病毒分離物，經(jīng)過效價測定、電鏡觀察、疑似病原RT-PCR/PCR檢測及E基因測序、核酸型鑒定、理化特性鑒定、血凝性測定、中和試驗及動物試驗，結(jié)果表明該分離株為鴨出血性卵巢炎病毒(Duckhemorrhagic hvaritis virus, DH0V),命名為DHOV JN株,屬黃病毒科、黃病毒屬、恩塔亞病毒群成員。2.細胞培養(yǎng)特性DHOV-JN分離株具有較廣的細胞適應譜，不僅能適應禽源細胞(CEF)、組織(SPF雞胚)，也能適應1 0(、8皿-21、31\￥61'0等哺乳動物傳代細胞系，也間接說明該病毒的宿主范圍可能較廣，對此應進行深入研究。考慮到細胞來源可控、無外源污染等因素，本研究選擇SPF源CEF作為分離、傳代、增殖該病毒的細胞，并取得成功，病毒能較好地適應CEF，效價也較高，達到105 5TCID5(i/0. lmL。這為進行病原鑒定、生物學特性、疫苗等研究奠定了極好的細胞平臺和研究基礎(chǔ)。3.病原學特點進行了電鏡觀察、理化特性、可疑病原檢測、基因測序和進化分析、病毒核酸型鑒定、血清中和研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)病毒粒子大于60nm、呈六邊形、有囊膜；該病毒對熱敏感(56°C 15min可滅活)，對氯仿、乙醚和堿敏感，對酸、胰酶不敏感；用AIV等8種禽源病毒RT-PCR/PCR和黃病毒RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，僅能檢出黃病毒核酸陽性，測定其E基因長 度為1503bp,構(gòu)建了基于黃病毒E基因的遺傳進化樹,發(fā)現(xiàn)該分離株屬黃病毒屬恩塔亞病毒群的成員；IUDR代謝試驗結(jié)果證實該分離株的核酸型為RNA ;該分離株不能被禽流感、新城疫、減蛋綜合癥、鴨肝炎、傳染性法氏囊、傳染性支氣管炎、番鴨呼腸孤以及禽網(wǎng)狀內(nèi)皮增生癥等8種常見禽源病毒的陽性血清所中和。4.病毒的致病性為驗證DHOV-JN株對禽類的致病性，我們進行了該毒株對SPF雞胚、SPF小雞、SPF蛋雞、雛鴨以及臨床健康蛋鴨的致病性試驗。結(jié)果發(fā)現(xiàn)DHOV-JN株可使9日齡SPF雞胚的發(fā)育顯著推遲，解剖發(fā)現(xiàn)胚體出血、成型雞胚的肝臟腫大、呈現(xiàn)“花斑肝”。DHOV-JN株能致死2日齡SPF小雞，一般3 5天死亡，死亡率為30% 50% ;初期雞只食欲較對照差，耐過后無影響；死亡雞解剖可見腦膜變軟，腎臟和脾臟稍微腫大。但該病毒對50日齡的SPF雞沒有顯著的臨床影響。但該病毒對剛孵出的2日齡雛鴨具有致死性，用DHOV-JN株攻擊2日齡雛鴨，實驗組全部死亡，解剖發(fā)現(xiàn)肝臟病變嚴重，多器官出血；對開產(chǎn)蛋鴨具有較強的致病性，解剖發(fā)現(xiàn)，實驗組的蛋鴨產(chǎn)蛋率嚴重下降，卵巢組織出現(xiàn)了卵泡液化、卵泡發(fā)育遲緩、出血以及輸卵管萎縮等現(xiàn)象，肝臟發(fā)黃、腫大、質(zhì)地變脆，脾臟腫大等。上述結(jié)果表明，分離自蛋鴨的DHOV-JN株對雞、鴨都具有極強的致病性，是否對鵝具有致病性由于時間關(guān)系本研究為開展試驗，但據(jù)黃欣梅(黃欣梅，李銀，趙冬敏，等.新型鵝黃病毒JS804毒株的分離與鑒定.江蘇農(nóng)業(yè)學報，2011，27 (2) :354 360.)等的研究，這種病毒對鵝也具有相似的致病性。這些結(jié)果證實，這種新分離到的禽黃病毒對家禽業(yè)具有顯著危害，需要加強流行病學、病原學、免疫學等研究。綜上所述I.該株病毒為鴨出血性卵巢炎病毒(Duck hemorrhagic hvaritis virus, DHOV)JN株，該株病毒已于2012年3月22日將該分離株送交北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號的中國科學院微生物研究所中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保存，保藏號為 CGMCCNo. 5907。2.該分離毒株主要特點(I)分離的鴨出血性卵巢炎病毒CGMCCNo. 5907株病毒從一種臨床癥狀稱為鴨出血性卵巢炎的病鴨采集肝臟、卵巢組織，用SPF源CEF分離獲得；(2)鴨出血性卵巢炎病毒 CGMCC No. 5907 株病毒能在 CEF、MDCK、Vero、BHK_21、ST和Marc-145單層細胞上進行增殖，并能致這些細胞產(chǎn)生較為一致的CPE ；(3)用 SPF 源 CEF 測得 CGMCC No. 5907 株病毒效價為 105_5TCID5(l/0. ImL ；(4) CGMCC No. 5907株病毒接種雞/和鴨能復制出典型的鴨出血性卵巢炎。3.鴨出血性卵巢炎病毒CGMCCNo. 5907株病毒用于制備鴨出血性卵巢炎滅活疫苗。4.鴨出血性卵巢炎病毒CGMCC No. 590本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護點】
一株鴨出血性卵巢炎病毒，其特征在于該株病毒為鴨出血性卵巢炎病毒DHOV？JN株，該株病毒已于2012年3月22日將該分離株送交北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號的中國科學院微生物研究所中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保存，保藏號為CGMCCNo.5907。
【技術(shù)特征摘要】
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：鄒敏，吳發(fā)興，劉東，劉新文，申洪銀，孫健，劉蕾，范根成，杜元釗，
申請(專利權(quán))人：青島易邦生物工程有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：
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