本發明專利技術公開了一種復合鴨α干擾素基因、其重組載體及應用。所述復合鴨α干擾素基因的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。本發明專利技術經優化后的復合鴨α干擾素基因可在畢赤氏酵母基因工程菌中表達生產復合鴨α干擾素，所得到的復合鴨α干擾素純度高：酵母表達的鴨α干擾素SDS-PAGE結果經薄層掃描顯示，重組酵母鴨α干擾素的目的條帶占總表達蛋白量的80%以上；抗病毒作用強：該新型基因組表達的蛋白與酵母表達的天然鴨α干擾素相比，有更好的抗病毒活性，其在鴨胚成纖維細胞上抵抗100TCID50VSV病毒感染的作用提高了40倍。可用于制備治療禽類病毒性疾病的藥物。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于生物工程領域，具體涉及一種復合鴨α干擾素基因、其重組載體及其在生產鴨α干擾素中的應用。
技術介紹
干擾素(interferon, IFN)是一組具有多種功能的活性蛋白質(主要是糖蛋白),是一種由單核細胞和淋巴細胞產生的細胞因子。它們在同種細胞上具有廣譜的抗病毒、影響細胞生長，以及分化、調節免疫功能等多種生物活性。干擾素是一種廣譜抗病毒劑，并不直接殺傷或抑制病毒，而主要是通過細胞表面受體作用使細胞產生抗病毒蛋白，從而抑制乙 肝病毒的復制；同時還可增強自然殺傷細胞(NK細胞)、巨噬細胞和T淋巴細胞的活力，從而起到免疫調節作用，并增強抗病毒能力。干擾素是動物機體最重要細胞因子之一，具有廣譜、高效的抗病毒功能，對免疫系統起關鍵調節作用。干擾素是一種廣譜抗病毒劑，并不直接殺傷或抑制病毒，而主要是通過細胞表面受體作用使細胞產生抗病毒蛋白，從而抑制乙肝病毒的復制；同時還可增強自然殺傷細胞(NK細胞)、巨噬細胞和T淋巴細胞的活力，從而起到免疫調節作用，并增強抗病毒能力。干擾素的作用具有物種局限性，不同物種的干擾素可能會有一定的交叉作用，如人干擾素在犬類應用也有一定效果，然而研究表明，大多數干擾素不能跨物種使用，干擾素用在本種動物才能發揮較好的抗病毒和免疫調控效果。九十年代,美國安進公司研究出一種全新的人復合alpha干擾素Infergen。這種復合干擾素是一種非自然的干擾素，166aa序列的獲得是通過對幾種天然alpha亞型干擾素序列的掃描，把最常見的氨基酸轉移到各個相應的位置。為便于分子構造，還另改變了 4個氨基酸。Infergen序列與alpha II型干擾素的同源性為88%,與beta干擾素的同源性為30%，且相似性較任何天然的α干擾素要高。實驗證明=Infergen的抗多種病毒的活性較天然的干擾素高5倍，按WHO人源干擾素抗病毒策略為標準得到其抗病毒活性為I X IO9U/mg ο近年來，雞干擾素(ChIFN)的研究與應用十分引人注目，尤其是其重組干擾素-α(rChIFN- α )在改善和治療A類傳染病(新城疫和禽流感)，以及傳染性法氏囊炎(IBD)和傳染性支氣管炎(IB)等病毒性疾病方面效果顯著，展示出了禽類干擾素的應用前景。禽類干擾素用于禽類疾病防制，可直接注射，也可通過飲水給藥。Marcu等采用飲水給藥的方法進行了重組ChIFN-α抗新城疫病毒的研究，雛雞I日齡起每天給予不同濃度的重組ChIFN- α (10、100、500、1 000,2 000 IU/mL)飲水，在2日齡時進行新城疫病毒La Sota株的攻毒試驗(點眼O. 5 mL (5 10)X 105 EID50/只)，研究表明高劑量的重組ChIFN-α可以延遲病癥的出現并且顯著降低試驗雞的發病程度。在試驗中，對照組雞只在7日齡出現致死性癥狀及組織學病變，而飲用高劑量(I 000,2 000 IU/mL)重組ChIFN-α的雞只則在整個試驗期間(12 d)精神狀態良好，與未攻毒的雛雞相比，無大體病變及組織學病變出現，500 IU/mL的重組ChIFN-α足以緩和新城疫引起的病理變化。與雞相比，鴨干擾素方面的研究相對較少。1995年，Schultz等以ChIFN-α基因為探針，從綠頭野鴨的基因組中克隆了鴨α-干擾素基因(DuIFN-a)，并在pET28A-E. coli和pcDNAI- C0S7表達系中進行了有效表達。Schult z等發現重組鴨干擾素-a (rDuIFN -a)能抑制VSV、NDV和A型流感病毒(Flu- A)的增殖，并建立了鴨病毒性肝炎(DHBV)-干擾素實驗系用于人類病毒性肝炎的模型研究。2004年，阮小飛等從北京鴨(A nas p latyr hy nchos d oestica L innaeus)基因組中克隆了其干擾素-α基因克隆片段長486 bp，編碼161個氨基酸的成熟肽。將該基因插入原核表達載體PQE30，在E. coli JM109工程菌中進行表達，重組蛋白以包涵體形式存在于E. coli. JM109工程菌中，在經過SM尿素變性、透析、復性后成為了具有抗病毒活性的重組鴨干擾素，抗水皰性口炎病毒(VSV)活性高達7. 9 X IO5IU/ mg。陳斌M等克隆了北京麻鴨生物信息學分析表明，麻鴨α -干擾素的開放性閱讀框有576個核苷酸組成，蛋白質相對分子質量為21kD，編碼191個氨基酸，其中前28個氨基·酸可能是信號肽部分，切割位點在28號氨基酸和29號氨基酸之間，基因序列中無內含子。繼而陳斌將麻鴨α-干擾素插入質粒PCDNA3. 1，將獲得的重組質粒作為免疫調節劑研究對DPV/DVH弱毒苗免疫活性調節作用，結果表明，含有麻鴨α _干擾素基因的重組表達質粒在鴨體內具有表達活性，并在一定時間內能促進和提高免疫和體液免疫應答，發揮著有效的正向免疫調節作用。以往干擾素的制備方法主要有兩種由誘生劑誘導動物細胞產生、原核表達。由誘生劑誘導產生鴨IFN-α，產生的干擾素產量少、成本高、純化工藝復雜，因而價格昂貴，極大程度上限制了臨床和科研的應用。原核表達系統中其產物主要以無生物活性的包涵體形式存在，若要想獲得具有生物活性的重組蛋白必須對包涵體進行變性、復性等繁瑣的后續處理工作，而后續處理工作中重組蛋白的損失量大而且對工作人員的技術水平要求也很高，這不利于工業化生產。
技術實現思路
本專利技術的一個目的在于提供一種復合鴨α干擾素基因。本專利技術的另一個目的在于提供含有復合鴨α干擾素基因的克隆載體。本專利技術的另一個目的在于提供含有復合鴨α干擾素基因的表達載體。本專利技術的另一個目的在于提供一種鴨α干擾素的生產方法。本專利技術所采用的技術方案是 一種復合鴨α干擾素基因，其核苷酸序列如SEQ ID Ν0:1所示，或是SEQ ID Ν0:1所示的序列經取代、缺失和/或增加一個或多個核苷酸和/或末端修飾后具有同等活性的序列。一種克隆載體，含有上述的復合鴨α干擾素基因。—種表達載體，含有上述的復合鴨α干擾素基因。其出發載體為酵母表達載體pPICZ a A、pPICZ a B 或 pPICZ α C。一種鴨α干擾素的生產方法，包括將上述的表達載體導入宿主細胞中，表達得到鴨α干擾素。所述宿主細胞為畢赤酵母X-33、GS115、KM71或SMD1168。由以上方法生產得到的鴨α干擾素。本專利技術的有益效果在于 本專利技術經優化后的復合鴨α干擾素基因可在畢赤氏酵母基因工程菌中表達生產復合鴨α干擾素。該方法得到的復合鴨α干擾素與天然鴨α干擾素和用大腸桿菌表達的天然鴨α干擾素相比具有下幾個優點 (1)本專利技術的復合鴨α干擾素表達量大、純度高酵母表達的鴨α干擾素SDS-PAGE結果經薄層掃描顯示，重組酵母鴨α干擾素的目的條帶占總表達蛋白量的80%以上； (2)抗病毒作用強該新型基因組表達的蛋白與酵母表達的天然鴨α干擾素相比，有更好的抗病毒活性，其在鴨胚成纖維細胞上抵抗Iootcid5ciVSV病毒感染的作用提高了 40倍； (3)無毒害物質酵母不會分泌像大腸桿菌表達的外源蛋白那樣附帶一些對鴨體細胞·有毒害的毒素。說明書附圖 圖I質粒pPICZ a-MDuIFNa質粒圖譜； 圖2重組表達載體pPICZ a-MDuIFNa的EcoRI和XbaI雙本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種復合鴨α干擾素基因，其核苷酸序列如SEQ？ID？NO:1所示，或是SEQ？ID？NO：1所示的序列經取代、缺失和/或增加一個或多個核苷酸和/或末端修飾后具有同等活性的序列。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：向華，黃元，王曉虎，陳晶，張健騑，
申請(專利權)人：廣東省農業科學院獸醫研究所，
類型：發明
國別省市：
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